Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e<em> Ex Vivo</em> Avaliação da migração celular Epicárdica derivado
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Uma única camada de linhas de células do epicárdio do coração, proporcionando factores parácrinos que estimulam a proliferação de cardiomiócitos e que contribui directamente progenitores cardiovasculares durante o desenvolvimento e a doença. Embora um certo número de factores têm sido implicados na célula (EPDC) mobilização derivado do epicárdio, os mecanismos que regem a sua migração e diferenciação subsequente são mal compreendidos. Aqui, apresentamos in vitro e as estratégias ex vivo para estudar EPDC motilidade e diferenciação. Em primeiro lugar, descreve-se um método de obtenção de células do epicárdio primárias por cultura excrescência do coração embrionário do rato. Nós também introduzir um protocolo detalhado para avaliar a migração tridimensional de EPDC marcado num sistema de cultura de órgãos. Nós fornecemos provas usando essas técnicas que deleção genética dos fatores de transcrição relacionados com myocardin no epicárdio atenua a migração EPDC. Esta abordagem serve como uma plataforma para avaliar modificadores candidatos da EPDCbiologia e pode ser utilizado para desenvolver telas genéticos ou químicas para identificar novos reguladores de EPDC mobilização que possam ser úteis para a reparação cardíaca.
Introduction
O epicárdio é uma única camada de células mesoteliais que reveste o coração e impactos cardíaca desenvolvimento, maturação e reparação. Através de uma troca altamente coordenada de sinais parácrinos, o diálogo íntimo entre o miocárdio e epicárdio é indispensável para o crescimento cardíaco e a formação de não-miócitos cardíacos linhagens 1. Células derivadas de epicárdio (EPDC) emergir a partir de um subconjunto de células do epicárdio através de um epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) 2, invadem o espaço subepicárdico e miocárdio subjacente, e se diferenciam em grande parte, em células murais vasculares coronárias e fibroblastos cardíacos, e para uma menor extensão, células endoteliais e cardiomiócitos 3-9.
Os mecanismos que regulam EMT epicárdico e EPDC invasão têm sido atribuídas à acção coordenada de vários ligandos, incluindo as moléculas segregadas 10-13, receptores da superfície das células e moléculas de adesão, 14,15 mentoLators de polaridade apical-basal, 16,17, 18,19 GTPases pequenas, e factores de transcrição 2,20,21. Enquanto muitos dos efectores moleculares de migração EPDC ter sido definida, uma melhor compreensão dos sinais fisiológicos que estimulam EPDC mobilização no embrião pode acelerar o desenvolvimento de estratégias para manipular este processo no adulto para melhorar a reparação cardíaca.
Estudos destinadas a identificação de novos reguladores de EPDC mobilização dependem de purificação desta população de células ou traçando a migração de células do epicárdio individuais. Um ou uma combinação de genes marcadores, incluindo WT1, Tcf21, Tbx18, e / ou ALDH1A2, é vulgarmente utilizada para identificar o epicárdio fetal 1. No entanto, a utilização destes marcadores para controlar a migração EPDC não é óptima quanto a expressão de marcadores do epicárdio diminui ao longo do desenvolvimento do coração e é muitas vezes perdida quando as células do epicárdio submetidos a transdifdiferen- em células mesenquimais.
A aplicação do sistema Cre / loxP, em conjunto com os repórteres de rastreamento de linhagem, tem sido útil na rotulagem permanentemente o epicárdio e seus descendentes durante o desenvolvimento do coração e após a lesão isquêmica no adulto 7,22,23. Várias linhas de Cre-restrito do epicárdio foram geradas e são amplamente usadas para rotular EPDC e para o gene condicional estratégias de exclusão 1. Estes estudos levaram à caracterização de várias linhagens do epicárdio, e a identificação de mediadores críticos de EPDC motilidade e diferenciação. No entanto, evidências acumuladas também sugere o epicárdio é uma população heterogênea de células progenitoras 4,24,25. Deste modo, apenas um subconjunto de células do epicárdio vai ser alvo utilizando um determinado condutor de Cre.
A fim de marcar todo o epicárdio independentemente da especificidade de Cre, um número de laboratórios utilizaram cul excrescênciasistemas tura ou ex vivo métodos de cultura de órgão para isolar fielmente ou marcar as células do epicárdio sem depender da expressão genética de uma linhagem marcadores 26-28. Para ex vivo estudos de migração, corações embrionárias são isoladas antes da EMT epicárdio e cultivadas em meio suplementado com uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Esta abordagem permite a marcação eficiente de todo o epicárdio ao invés de um subconjunto de células, a recombinação mediada por Cre. Culturas cardíacos são subsequentemente expostas a indutores conhecidos de EMT para estimular a mobilização de EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo são complementadas por análises in vitro Culturas de explantes do epicárdio, que são uma abordagem particularmente útil para explorar mecanismos detalhados condução migração EPDC.
Aqui, descrevemos métodos para isolar as células do epicárdio primárias para estudos in vitro de epicardiai EMT, bem como um sistema de cultura de órgãos ex vivo para análises de EPDC motilidade. Recentemente, demonstrou a utilidade e robustez deste método pelo geneticamente modulando o factor relacionado com myocardin transcrição (MRTF) / factor de resposta do soro (SRF) eixo sinalização para manipular a migração baseado em actina de EPDC 9. Enquanto nossos resultados destacam uma via de sinalização necessária para regular a migração EPDC, estes métodos são adequados para desvendar os mecanismos que coletivamente orquestram a migração EPDC e diferenciação. Além disso, o ex vivo sistemas de cultura de explante e poderia ser implementado em telas funcionais para identificar novos reguladores de EPDC mobilização para aplicações terapêuticas em regeneração cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui destacamos métodos detalhados para isolar células do epicárdio primária por conseqüência e controlar a migração EPDC em ex vivo culturas cardíacos. Para as culturas conseqüência, o tempo apropriado para remover o coração empobrecido-epicárdio varia ligeiramente entre os experimentos. A monitorização periódica dos explantes após uma incubação durante a noite é recomendado para avaliar a extensão da excrescência do epicárdio e para extrair o coração diante de fibroblastos aparecer. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [número de concessão R01HL120919]; a American Heart Association [número de concessão 10SDG4350046]; Universidade de Rochester prêmio CTSA do NIH [número de concessão UL1 TR000042]; e os fundos de inicialização do Aab CVRI. MAT foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia da Med Into–Grad Iniciativa Howard Hughes Medical Institute; e um Prêmio de Serviço Institucional Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa do NIH [número de concessão GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
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