Epikardiella utväxt Kultur-analys och<em> Ex vivo</em> Bedömning av epikardiella-härledda cellmigration
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Ett enda skikt av epikardiella cellinjer hjärtat, vilket ger parakrina faktorer som stimulerar cardiomyocyte proliferation och direkt bidrar kardiovaskulära progenitorer under utveckling och sjukdom. Medan ett antal faktorer har varit inblandade i epikardium härrörande cell (EPDC) mobilisering är de mekanismer som styr deras efterföljande migration och differentiering dåligt kända. Här presenterar vi in vitro och ex vivo strategier för att studera EPDC motilitet och differentiering. Först beskriver vi en metod för att erhålla primära epikardiella celler genom utväxt kultur från den embryonala mus hjärta. Vi presenterar också ett detaljerat protokoll för att bedöma tredimensionella migration av märkt EPDC i ett organkultursystem. Vi styrka med hjälp av dessa tekniker som genetisk deletion av myocardin relaterade transkriptionsfaktorer i epikardium dämpar EPDC migration. Denna strategi fungerar som en plattform för att utvärdera kandidatmodifierings av EPDCbiologi och skulle kunna användas för att utveckla genetiska eller kemiska skärmar för att identifiera nya regulatorer av EPDC mobilisering som kan vara användbara för hjärt reparation.
Introduction
Epikardium är ett enda skikt av mesotelceller som linjer hjärtat och effekter hjärt utveckling, mognad och reparation. Genom ett starkt samordnat utbyte av parakrina signaler, är oumbärlig för hjärt tillväxt och bildandet av icke-myocyt hjärt linjer 1 intim dialog mellan hjärtmuskeln och epikardium. Epikardiella härledda celler (EPDC) dyker upp från en delmängd av epikardiella celler genom en epitelial-till-mesenkymala övergång (EMT) 2, invadera subepicardial utrymme och underliggande myokardium, och differentierar till stor del in i krans vaskulära väggceller och hjärt fibroblaster, och till en mindre utsträckning, endotelceller och kardiomyocyter 3-9.
De mekanismer som reglerar epikardiell EMT och EPDC invasion har tillskrivits den samordnade åtgärder av olika molekyler inkluderande utsöndrade ligander 10-13, cellytreceptorer och adhesionsmolekyler 14,15, förordrer av apikal-basal polaritet 16,17, små GTPases 18,19, och transkriptionsfaktorer 2,20,21. Även om många av de molekylära effektorer av EPDC migration har definierats, till en bättre förståelse av de fysiologiska signaler som stimulerar EPDC mobilisering i embryot kan påskynda utvecklingen av strategier manipulera denna process i den vuxna för förbättrad hjärt reparation.
Studier som syftar till att identifiera nya regulatorer av EPDC mobilisering lita på rening av denna cellpopulation eller spåra migration av enskilda epikardiella celler. En eller en kombination av markörgener, inklusive WT1, Tcf21, Tbx18, och / eller Aldh1a2, används ofta för att identifiera den fetala epikardium 1. Emellertid till användningen av dessa markörer spåra migrera EPDC inte är optimal eftersom uttryck av epikardiella markörer avtar under loppet av hjärtutveckling och är ofta förlorade när epikardiella celler undergår transdifpassad in i mesenkymala celler.
Tillämpningen av Cre / loxP-systemet, i samband med linje-spårning reportrar, har varit till nytta för permanent märkning av epikardium och dess ättlingar under hjärt utveckling och efter ischemisk skada i vuxen 7,22,23. Har genererats flera epikardiella begränsade Cre linjer och används ofta för att märka EPDC och för villkorlig gendeletion strategier 1. Dessa studier har lett till karakteriseringen av olika epikardiella linjer, och identifiering av kritiska förmedlare av EPDC motilitet och differentiering. Tyder emellertid på att ackumulera bevis också epikardium är en heterogen population av progenitorceller 4,24,25. Således kommer endast en delmängd av epikardiella celler målsökas med användning av en given Cre förare.
För att märka hela epikardium oavsett Cre specificitet, har ett antal laboratorier utnyttjade utväxt culture system eller ex vivo organodlingsmetoder för att troget isolera eller märka epikardiska celler utan beroende på uttrycket av en genetisk härstamning markörer 26-28. För ex vivo studier migration, är embryonala hjärtan isoleras före epikardiell EMT och odlades i medium kompletterat med ett grönt fluorescerande protein (GFP) -uttryckande adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Detta tillvägagångssätt möjliggör effektiv märkning av hela epikardium i stället för en underuppsättning av celler genom Cre-medierad rekombination. Hjärta kulturer därefter utsätts för kända inducerare av EMT att stimulera mobiliseringen av EPDC 28,29. Ex vivo och in vivo analyser kompletteras med in vitro epikardiella Explantation kulturer, som är en särskilt användbar metod för att utforska detaljerade mekanismer som driver EPDC migration.
Här beskriver vi metoder för att isolera primära epikardiella celler för in vitro studier av epicardial EMT, samt ett organ odlingssystem för ex vivo-analyser av EPDC motilitet. Vi har nyligen visat nyttan och robusthet denna metod genom genetiskt modulera myocardin relaterade transkriptionsfaktor (MRTF) / serumresponsfaktorn (SRF) signalerar axel för att manipulera aktin baserad migrering av EPDC 9. Medan våra iakttagelser markerar en reaktionsväg som är nödvändiga för att reglera EPDC migration signalering, är dessa metoder är lämpliga för unraveling de mekanismer som kollektivt orkestrera EPDC migration och differentiering. Vidare kan explantatet och ex vivo kultursystem implementeras i funktionella skärmar för att identifiera nya regulatorer av EPDC mobilisering för terapeutiska tillämpningar i hjärtregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här redogör vi detaljerade metoder för att isolera primära epikardiella cell genom utväxt och spåra EPDC migration i ex vivo hjärt kulturer. För utväxt kulturer, lämplig tidpunkt för att avlägsna epikardium utarmade hjärta varierar något mellan experiment. Regelbunden kontroll av explantaten efter en inkubation över natten rekommenderas att bedöma omfattningen av epikardiella utväxt och extrahera hjärtat före fibroblaster visas. För att säkerställa renhet, bör hjärtan tas bort inom 24 ti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (NIH) [licensnummer R01HL120919]; American Heart Association [licensnummer 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA utmärkelse från NIH [licensnummer UL1 TR000042]; och start medel från Aab CVRI. MAT stöddes delvis av bidrag till University of Rochester School of Medicine och tandvård från Howard Hughes Medical Institute Med-I-Grad initiativet; och ett institutionellt Ruth L. Kirschstein National Research Service Award från NIH [licensnummer GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
