Trascrittoma Profiling di<em> In-Vivo</em> Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori
Summary
Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.
Abstract
Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.
Introduction
All'inizio perdita embrionale nelle vacche ad alta produzione di latte è una delle principali sfide del settore lattiero-caseario 1, 2. Bovina è diventato un modello interessante per studiare lo sviluppo preimpianto dell'embrione umano a causa del loro processo di sviluppo simile a 3, 4. Tuttavia, più ricerca è necessaria per avere una migliore comprensione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale precoce bovina.
Dopo venti anni dalla prima tecnologia microarray sviluppato nel 1995 5, lo sviluppo di più sofisticate tecnologie sonda fabbricazione errori di stampa ridotti e variabilità dei chip a matrice all'interno e tra le diverse piattaforme di microarray 6. La tecnologia microarray migliorata determinato un ampiamente l'applicazione di questa tecnologia nel campo della ricerca clinica 7 e, più recentemente, in embrione precoce qvalutazione ualità 8.
La grande quantità di materiale necessario per la tecnologia microarray è la ragione principale per cui la tecnologia microarray inizialmente non è riuscito a entrare in un certo numero di campi di ricerca come sviluppo embrionale precoce. Più di recente, i metodi di amplificazione di RNA sono stati migliorati per amplificare linearmente RNA fino al livello microgrammi da sub-nanogrammo materiale di partenza di RNA 9. Ci sono diversi kit RNA amplificazione commerciali disponibili sul mercato; tuttavia, il più popolare kit ben sviluppati sono legati alla Ribo-Single Primer isotermica di amplificazione 10 e T7 promotore guidato 11 metodi. Il più popolare di amplificazione RNA antisenso utilizza nella trascrizione vitro con un oligo dT fondo il collegamento a un promotore T7 a 5 '12. Questa tecnologia consente di mantenere più di trascritti rappresentativi anti-senso dopo amplificazione lineare fo array ibridazione 13. Questo metodo è stato adattato per amplificare il livello picogrammi di RNA totale estratto da embrioni bovini 8.
Universale Linkage System (ULS) è il metodo di etichettatura che incorpora direttamente il DNA o RNA amplificato con colorante fluorescente in platino-linked sia Cyanine 547 o 647 Cyanine, formando un legame coordinativo sulla posizione N7 della guanina 14. Questo metodo è stato adattato nella ricerca embrioni per generare più stabile amplificato ARNA senza modifiche rispetto al aminoallyl modificati su ARNA generata dal metodo enzimatico 15. metodi sia singolo colorante ed etichettatura due coloranti sono stati adattati utilizzando universale Linkage System nella microarray. Un ampio studio confronti microarray è che vi è una buona correlazione della qualità dei dati tra le piattaforme di array uno o due colori 6.
Recentemente, sia in auto promotore T7Metodi n amplificazione RNA antisenso ed etichettatura ULS sono stati sviluppati per fornire un protocollo più affidabile per generare una quantità sufficiente di alta qualità etichettati materiali ARNA per microarray ibridazione 8, 16. Pertanto, questo studio fornisce un protocollo per dimostrare alcune importanti passi da estrazione di RNA per l'analisi dei dati coinvolti in microarray due colori usando Giorno 7 embrioni bovini come esempio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il primo problema di effettuare analisi di microarray usando Giorno 7 embrioni di bovini non è sempre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per lo studio dell'espressione genica. estrazione di RNA fenolo Tradizionale / cloroformio e metodo di precipitazione in etanolo non è raccomandato per Giorno 7 embrioni, con conseguente bassa resa e la possibile fenolo avanzi di inibire la reazione di amplificazione di RNA. Invece, un metodo basato su colonne standard è preferibile isolare l'RNA totale e quin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research supported by Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates – BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.
Materials
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2X Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25X Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10X GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | – |
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