非具体的に水溶性化合物でSCA1マウスの治療は、ミトコンドリア機能を高めます
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
ミトコンドリア機能障害は老化のプロセスで、いくつかの遺伝性脊髄小脳失調症と小脳の進行性変性によってマークされ、他の運動障害などの神経変性疾患において重要な役割を果たしています。このプロトコルの目的は、脊髄小脳失調症1型（SCA1）におけるミトコンドリア機能障害を評価し、疾患の進行を遅らせるために、水溶性の化合物のコハク酸を介して代謝呼吸の薬理学的標的化の有効性を評価することです。このアプローチは、他の小脳疾患に適用可能であり、水溶性の治療のホストに適合させることができます。
ミトコンドリア呼吸のex vivo分析は、ミトコンドリア機能の疾患に関連する変化を検出し、定量化するために使用されます。遺伝的証拠（未発表データ）とSCA1マウスモデルにおけるミトコンドリア機能障害のプロテオミクス証拠により、我々は、水溶性代謝ブースターSを用いた治療の有効性を評価しますホームケージの飲料水に直接この化合物を溶解することによりuccinic酸。血液脳関門を通過する薬剤の能力は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて推定することができます。これらの化合物の有効性は、その後、加速ロータロッド、バランスビームテスト及びフットプリント分析を含む、複数の行動パラダイムを用いて試験することができます。小脳の細胞構築完全性は、プルキンエ細胞核とプルキンエ細胞の樹状突起と細胞体を検出する免疫アッセイを用いて評価することができます。これらの方法は、ミトコンドリア機能障害および小脳の神経変性疾患における水溶性化合物を用いた治療の有効性を決定するための強固な技術です。
Introduction
ミトコンドリア電子輸送鎖を使用して、酸化的リン酸化（OXPHOS）を経て製造ミトコンドリアのATPの大部分で、アデノシン三リン酸（ATP）、細胞エネルギーのために必須の補酵素の主要な生産者です。脳は、その高い代謝要求と神経活動に電力を供給するための酸化的リン酸化への依存を与え、ミトコンドリア機能障害の影響を非常に受けやすいです。その結果、ミトコンドリア機能障害は、老化プロセス中にトリガされます 1及び複数の神経変性疾患2、3、4の病因に関与しています。したがって、ミトコンドリアは、神経変性のための魅力的な治療標的であることになります。
このプロトコルでは、我々はミトコンドリアの研究のためのモデルの神経変性疾患などの脊髄小脳失調症1型（SCA1）の使用を採用していますリットル機能障害およびミトコンドリア標的療法の開発。 SCA1は、他の脳領域のプルキンエ小脳のニューロンとニューロンの進行性変性をトリガアタキシン1遺伝子産物におけるポリグルタミン（ポリQ）リピート伸長変異によって引き起こされます。プルキンエ細胞特異的プロモーターの制御下でポリQ突然変異体アタキシン1導入遺伝子を発現する（SCA1マウスと命名）は、ここで使用されるトランスジェニックマウス系統は、SCA1 5のプルキンエ細胞成分の標的分析を可能にします。 SCA1マウスは緩やかなプルキンエ細胞の変性を受け、失調性歩行6を開発します。
ミトコンドリア複合体の機能不全とミトコンドリア標的治療の有効性は、分子や行動アッセイの電池を用いて評価することができます。ミトコンドリア複合体機能障害は小脳組織内の変更された酸素消費量を検出する呼吸アッセイによりex vivoで測定され、電子伝達鎖基質および阻害剤7が存在します。呼吸アッセイは、以前に透過性の組織、ミトコンドリアの単離物、および全組織7、8、9で使用されてきました。これらは、透過型電子顕微鏡または免疫蛍光染色などの形態学的データの収集方法とは異なり、ミトコンドリア機能を直接評価することを可能にします。組織全体ではなく、単離ミトコンドリアの使用は、単離工程7の間に発生する可能性があり、健康なミトコンドリアのバイアスされた選択を防ぐことができます。示されるように、プロトコルに適合したときに、呼吸アッセイは、小脳の神経変性疾患状態においてミトコンドリア機能障害を検出するための有益な方法です。
代謝の非特異的活性化は、神経変性diseasのトランスジェニックマウスモデルにおいてミトコンドリア機能障害を推定するために使用することができeと新しい治療法の開発に役立ちます。ケルセチン、コエンザイムQ10およびクレアチンは、全ての患者において神経変性病10、11、12、13、14、15、16の動物モデルにおいて神経変性疾患の病状を改善することが示されています。ここでは、代謝を促進し、神経変性疾患でミトコンドリアの機能を高めるための新規な代謝賦活剤、コハク酸を、提示します。活性化剤は、血液脳関門を通過していることを確実にするために、HPLCを処置したマウス17の神経組織への送達を検出するために使用しました。
コハク酸のような代謝的に標的と水溶性化合物の治療効果を評価するために、行動パラダイム及び免疫病理学的研究の電池を使用することができます。デュ小脳の神経変性疾患、フットプリントの滑走路アッセイ、ビームアッセイ加速回転棒アッセイに見られる運動協調の障害に電子が行動病理6、18、19の救助を検出するために使用されます。これらの措置は、小脳組織6、20、21の定義された小葉内の分子（プルキンエ細胞の樹状突起樹の長さとして定義された）層の厚さとプルキンエ細胞体数を評価することによって小脳細胞構築の免疫病理学的評価を補っています。ここでは、代謝的に標的と水溶性化合物を用いたミトコンドリア機能障害の検出および治療のための複数の神経病理学的および行動の方法を提示します。
私たちは、SCA1のTRANにミトコンドリア機能障害を分析するために、ミトコンドリア呼吸のex vivo分析を使用しますsgenicマウス。さらに、我々は、疾患の症状および病状がさらにSCA1疾患の進行におけるミトコンドリア機能障害が関与し、水溶性のミトコンドリアブースタコハク酸によって改善されることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
説明したように、これらの方法を使用する場合、それらは、小脳の神経変性疾患のマウスモデルにおける酸化的リン酸化によって媒介されるミトコンドリア機能不全を検出し、緩和することが可能です。組み合わせた生化学的および行動アッセイは、小脳の神経変性疾患の病態にミトコンドリアの寄与の程度を決定するための多面的な方法です。代謝を促進し、ミトコンドリア機能を高める?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
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