Behandla SCA1 Möss med vattenlösliga föreningar till icke-specifikt öka mitokondriell funktion
Summary
We present a biochemical and behavioral protocol to evaluate the efficacy of mitochondria-targeted water-soluble compounds for the treatment of Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) and other cerebellar neurodegenerative diseases.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion spelar en betydande roll i åldrandet och vid neurodegenerativa sjukdomar inklusive flera ärftliga spinocerebellär ataxi och andra rörelserubbningar som är markerade av progressiv degeneration av cerebellum. Målet med detta protokoll är att bedöma mitokondriell dysfunktion Spinocerebellär ataxi typ 1 (SCA1) och bedöma effekten av farmakologisk målinriktning av metabolisk andning via vattenlösliga föreningen bärnstenssyra för att bromsa sjukdomsförloppet. Denna metod är tillämplig på andra cerebellär sjukdomar och kan anpassas till en mängd vattenlösliga terapier.
Ex vivo-analys av mitokondriell andning används för att detektera och kvantifiera sjukdomsrelaterade förändringar i mitokondriell funktion. Med genetiska bevis (opublicerade data) och proteomik tecken på mitokondriell dysfunktion i SCA1 musmodell utvärderar vi effekten av behandling med vattenlösliga metaboliska booster succinic syra genom upplösning av denna förening direkt i hemmaburen dricksvatten. Förmågan hos läkemedlet att passera blod-hjärnbarriären kan härledas med användning av högupplösande vätskekromatografi (HPLC). Effekten av dessa föreningar kan sedan testas med hjälp av flera beteende paradigm inklusive accelererande rotarod, balansbom test och footprint-analys. Cytoarchitectural integritet lillhjärnan kan bedömas med hjälp av immunofluorescens analyser som detekterar Purkinje cellkärnor och Purkinje cell dendriter och soma. Dessa metoder är robusta tekniker för att bestämma mitokondriell dysfunktion och effekten av behandling med vattenlösliga föreningar i cerebellär neurodegenerativ sjukdom.
Introduction
Mitokondrier är de viktigaste producenterna av adenosintrifosfat (ATP), en viktig coenzym för cellenergi, med de flesta av mitokondriell ATP framställs genom oxidativ fosforylering (OXPHOS) med hjälp av elektrontransportkedja. Hjärnan, med tanke på dess höga metaboliska krav och dess beroende av oxidativ fosforylering för att driva neural aktivitet, är mycket känslig för mitokondriell dysfunktion. Som ett resultat, är mitokondriell dysfunktion aktiveras under åldrandet 1 och är implicerad i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar 2, 3, 4. Härav följer att mitokondrierna är attraktiva terapeutiska mål för neurodegeneration.
I detta protokoll, har vi antagit användningen av Spinocerebellär ataxi typ 1 (SCA1) som förebild neurodegenerativ sjukdom för studier av mitokondrierl dysfunktion och utveckling av mitokondrie-inriktade terapier. SCA1 orsakas av en polyglutamine (polyQ) repeat expansions mutation i ataxin-1-genprodukten vilket utlöser progressiv degeneration av Purkinje-neuroner i cerebellum och neuroner i andra delar av hjärnan. Den transgena musen linje som används här (betecknad som den SCA1 mus), som uttrycker en polyQ-mutant ataxin-1-transgenen under kontroll av en Purkinje-cellspecifik promotor, möjliggör den riktade analys av Purkinje-cellkomponenten i SCA1 5. SCA1 möss genomgår gradvis Purkinje celldegeneration och utveckla ataktisk gång sex.
Mitokondriell komplex dysfunktion och mitokondrie-riktad behandling effekten kan utvärderas med ett batteri av molekylära och beteendemässiga analyser. Mitochondrial komplex dysfunktion mäts ex vivo genom andnings analyser som detekterar förändrad syreförbrukning inom cerebellar vävnad inärvaron av elektrontransportkedjan substrat och hämmare 7. Respirations analyser har tidigare använts med permeabiliserad vävnad, mitokondriella isolat, och hela vävnad 7, 8, 9. De gör det möjligt för direkt bedömning av mitokondriefunktion i motsats till morfologiska metoder för datainsamling såsom transmissionselektronmikroskopi eller immunofluorescensfärgning. Användningen av hela vävnad snarare än isolerade mitokondrier förhindrar snedvridet urval av friska mitokondrier som kan uppstå under isoleringsprocessen 7. Efter anpassning till protokollet som visas, är andningsanalysen en värdefull metod för att detektera mitokondriell dysfunktion i cerebellära neurodegenerativa sjukdomstillstånd.
Icke-specifika aktivatorer av metabolism kan användas för att sluta sig till mitokondriell dysfunktion i transgena möss modeller av neurodegenerativa disease och stöd i utvecklingen av nya terapier. Quercetin, koenzym Q10 och kreatin har alla visat sig lindra neurodegenerativ sjukdomspatologi hos patienter och i djurmodeller för neurodegenerativ sjukdom 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. Här presenterar vi en ny metabolisk aktivator, bärnstenssyra, för att stimulera metabolismen och öka mitokondriefunktion i neurodegenerativ sjukdom. För att säkerställa att aktivatorn korsa blod-hjärnbarriären, var HPLC användas för att detektera leverans till neural vävnad hos behandlade möss 17.
För att utvärdera de terapeutiska effekterna av metaboliskt riktade vattenlösliga föreningar, såsom bärnstenssyra, kan användas ett batteri av beteendeparadigm och immunopatologiska studier. due för samordnings motor brister som konstaterats i cerebellar neurodegenerativ sjukdom, fotavtrycket banan analysen balk analys och accelererande roterande staven analys används för att detektera rädda beteende patologi 6, 18, 19. Dessa åtgärder kompletteras med immunpatologisk bedömning av cerebellär cytoarchitecture genom att bedöma molekylskikttjocklek (definierat som Purkinje cell dendritiska berså längd) och Purkinje cell soma räknas inom ett definierat lob av cerebellär vävnad 6, 20, 21. Här presenterar vi flera neuropatologiska och beteende metoder för upptäckt och behandling av mitokondriell dysfunktion med metaboliskt riktade vattenlösliga föreningar.
Vi använder ex vivo analys av mitokondrie-andning för att analysera mitokondriell dysfunktion i SCA1 transgenic mus. Dessutom visar vi att sjukdomssymptom och patologi förbättras genom den vattenlösliga mitokondriell booster bärnstenssyra, ytterligare blandar mitokondriell dysfunktion SCA1 sjukdomsförloppet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om dessa metoder används som beskrivs, de kan upptäcka och minska oxidativ fosforylering-medierad mitokondriell dysfunktion i cerebellära neurodegenerativa sjukdomar musmodeller. De kombinerade biokemiska och beteendemässiga analyser är mångfacetterade metoder för att bestämma omfattningen av mitokondriella bidrag till cerebellär neurodegenerativ sjukdom patologi. Genom att behandla möss med bärnstenssyra för att stimulera ämnesomsättningen och öka mitokondriefunktion, har vi möjlighet att visa en räddn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Harry Orr at the University of Minnesota for his generous gift of transgenic mice. We would also like to thank the following Skidmore College alum for their work performing the preceding experiments: Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson and Cheyanne Slocum. Furthermore, we would like to thank Skidmore College for funding the development of these methods.
Materials
| Adenosine diphosphate | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| Donkey serum | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Glutamate | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| Malate | Sigma Aldrich | 6994 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Potassium-lactobionate | Bio-Sugars | 69313-67-3 | |
| Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 47036 | |
| Succinic Acid | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| Antibodies | |||
| 11NQ antibody (anti-ataxin-1 ) | Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary antibody | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary antibody | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin antibody (goat) | Santa Cruz | C-20 | |
| Animals | |||
| Control transgenic mice | Harry Orr, Ph.D. | A02 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| SCA1 mice | Harry Orr, Ph.D. | B05 | Burright, et al. 1997, PMID: 9217978 |
| Wildtype mice | The Jackson Laboratory | 001800 | |
| Equipment | |||
| ESM-100L microtome | ERMA | Sledge microtome | |
| Fluoview FV1200 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Glycerol-gelatin slides | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| Hamilton syringe | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 Oxytherm Electrode Control Unit | Hansatech Instruments | ||
| P.T.F.E. paper | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion Rotarod | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Software | |||
| ImageJ | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Cell counter plugin (for ImageJ) | National Institute of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3 (rotarod software) | PPP&G | contact corresponding author for information | |
| Phidget21.dll (required for rotarod software) | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
References
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men. J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).
- Breuer, M. E., et al. The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases. Neurobiol Dis. , (2012).
- Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2014, 175062 (2014).
- Burright, E. N., et al. SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat. Cell. 82 (6), 937-948 (1995).
- Clark, H. B., et al. Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations. J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).
- Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function. J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).
- Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).
- Ferrante, R. J., et al. Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington’s disease. J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).
- Ferrante, R. J., et al. Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington’s disease. J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).
- Hersch, S. M., et al. Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2’dG. Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).
- Yang, L., et al. Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson’s and Huntington’s diseases. J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).
- Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).
- Sandhir, R., Mehrotra, A. Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington’s disease. Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).
- Ergonul, P. G., Nergiz, C. Determination of organic acids in olive fruit by HPLC. ‘Czech Food Sci. 28 (3), 202-205 (2010).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).
- Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam. J Vis Exp. (49), (2011).
- Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals. Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).
- Klement, I. A., et al. Ataxin-1 nuclear localization and aggregation, role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell. 95 (1), 41-53 (1998).
- Serra, H. G., et al. Gene profiling links SCA1 pathophysiology to glutamate signaling in Purkinje cells of transgenic mice. Hum Mol Genet. 13 (20), 2535-2543 (2004).
- Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington’s disease mutation. J Neurosci. 19 (8), 3248-3257 (1999).
- Anjomani Virmouni, S., et al. A novel GAA-repeat-expansion-based mouse model of Friedreich’s ataxia. Dis Model Mech. 8 (3), 225-235 (2015).
