Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Efficiente conduzione nervosa nel sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) richiede mielinizzazione degli assoni dagli oligodendrociti. Durante lo sviluppo, oligodendrociti nascono da un pool di cellule progenitrici degli oligodendrociti (OPC) che si pensa di migrare dalle zone ventricolari del prosencefalo sviluppo e tubo neurale 1. Dopo OPC migrazione differenziano in maturi, oligodendrociti mielinizzanti che non solo facilitare l'utilizzo efficiente di propagazione degli impulsi, ma anche fornire gli assoni con il supporto trofico 2. L'adulto CNS mantiene una popolazione abbondante di OPC che si disperdono in tutta la materia grigia e bianca che comprende circa il 5-8% di tutte le cellule 3. A seguito di un insulto demielinizzante, OPC migrano al sito di lesione, proliferano e si differenziano per sostituire guaine mieliniche persi o danneggiati in assoni esposti. Tuttavia, in alcune impostazioni malattia / infortunio, questo processo si trova ad essere inefficiente o può fallire completamente 4. Mentredemielinizzazione cronica è pensato di aggiungere al peso della malattia, oligodendrogenesis e rimielinizzazione efficiente può alleviare i sintomi 5. È stato quindi interessante studiare OPC in vitro per determinare l'effetto di fattori sperimentali oligodendrogenesis.
Insight nelle diverse fasi di differenziazione degli oligodendrociti è stato reso possibile tramite l'identificazione di marcatori cellulari specifici stadi. Auto-rinnovamento delle cellule progenitrici precoci sono definite dalla loro espressione del fattore di crescita derivato dalle piastrine del recettore alfa (PDGFRα), neurale / glia antigene 2 (NG2) e A2B5 6-8. Come OPC iniziano il loro programma di differenziazione e si ritirano dal ciclo cellulare, che downregulate espressione di questi marcatori e cominciano a esprimere le proteine indicativi di premyelinating oligodendrociti tra ciclico-nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNPase) e O4. Infine, la loro differenziazione in oligodendroc più maturoYtes si caratterizza per l'espressione di proteine della mielina-associata, tra cui glicoproteina mielina-associata (MAG), proteolipid proteina (PLP), e proteina basica della mielina (MBP). MBP è una proteina periferica di membrana intracellulare e una componente importante della guaina mielinica. Topi privi MBP sviluppano una grave fenotipo in cui CNS mielinizzazione è significativamente diminuiti con conseguente tremori, convulsioni e morte precoce 9,10. Questo ruolo importante MBP in myelination ha portato al suo uso come marker di differenziazione degli oligodendrociti sia in vitro che in vivo 11.
La quantificazione del MBP può essere effettuata mediante diverse metodologie differenti. RT-PCR e analisi Western Blot consentono per la quantificazione dei livelli di MBP sotto diversi regimi di trattamento. Immunocytochemistry è un approccio qualitativo comune che può anche essere quantitativa quando si utilizzano approcci microscopia basati su telecamere. Sebbene questi sistemi sono affidabili e fondamentale perlo studio della differenziazione degli oligodendrociti, ognuno ha i propri svantaggi che limitano il loro uso in screening di stupefacenti. In primo luogo, la quantità di OPC primari che sono necessari per la RT-PCR ed analisi Western blot riduce il numero di variabili che possono essere esaminati simultaneamente. Mentre il requisito cella per immunocitochimica è molto più basso, consistente lasso di tempo deve essere dedicato a ogni esperimento, se la quantificazione è l'obiettivo. Numerose immagini devono essere catturate e poi quantificati per facilitare l'analisi sperimentale. Questi avvertimenti diventano ostacoli importanti da considerare per gli studi che richiedono la valutazione elevato throughput. Qui si descrive un metodo che utilizza aspetti fondamentali sia dal immunocitochimica e metodologie Western Blot per mielina quantificazione, riducendo significativamente sia il numero di cellule necessario e il tempo per completare l'analisi quantitativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui descrive un metodo veloce e affidabile per isolare OPC ratto e quantificare in oligodendrogenesis vitro in risposta a fattori sperimentali. Utilizzando selezione positiva, alte rese di OPC vitali e puri sono utilizzati direttamente a fini sperimentali. Questo metodo semplifica l'isolamento, la coltura, e passi differenziazione in un arco di tempo 1 Settimana, e cellule fissate possono essere convenientemente conservato a 4 ° C per diverse settimane senza alcuna perdita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Concedere sponsor: National Institutes of Health; codice di autorizzazione: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
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