Summary

デュアル赤外線蛍光スキャンを用いてラットオリゴデンドロサイト前駆細胞培養およびOligodendrogenesisの定量化の準備

Published: February 17, 2016
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Summary

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Abstract

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Introduction

哺乳動物の中枢神経系(CNS)における効率的な神経伝導がオリゴデンドロサイトによって軸索の髄鞘形成を必要とします。開発中に、オリゴデンドロサイトは、開発前脳と神経管1の心室ゾーンから移行すると考えられているオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPCの)のプールから生じます。移行後のOPCは、効率的なインパルスの伝播を促進するだけでなく、栄養サポート2と軸索を提供するだけでなく、オリゴデンドロサイトをミエリン形成、成熟へと分化します。成体CNSは、すべてのセル3の約百分の5から8までを含む、グレーと白質全体に分散されているOPCの豊富な人口を維持します。脱髄傷害後、OPCが、損傷部位に遊走増殖し、露出した軸索上の紛失または破損したミエリン鞘を置き換えるために分化します。しかし、いくつかの疾患/損傷の設定では、このプロセスは非効率的であることが見出されたまたは完全に4失敗することができます。同時に慢性脱髄は、症状5を軽減することができる疾患、効率的oligodendrogenesisおよび再ミエリン化の負担に追加すると考えられています。したがって、oligodendrogenesisに関する実験要因の影響を決定するために、in vitroでのOPCを研究するために注目されています。

乏突起膠細胞の分化の異なる段階への洞察は、ステージ特異的な細胞マーカーを同定することによって可能となりました。 8 自己再生初期前駆細胞は、血小板由来増殖因子受容体α(PDGFRα)、神経/グリア抗原2(NG2)とA2B5 6の発現によって定義されます。 OPCには、それらの分化プログラムを開始し、細胞周期から撤退したように、彼らは、これらのマーカーの発現をダウンレギュレートし、環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ(CNPアーゼ)とO4を含むオリゴデンドロサイトをpremyelinatingを示すタンパク質を発現し始めます。最後に、より成熟したoligodendrocへの分化ytesは、​​ミエリン関連糖タンパク質(MAG)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、およびミエリン塩基性タンパク質(MBP)などのミエリン関連タンパク質の発現によって特徴付けられます。 MBPは、細胞内の末梢膜タンパク質およびミエリン鞘の主要な成分です。 MBP欠損したマウスは、CNSミエリン形成が大幅に震え、痙攣、早期死亡9,10につながる減少している深刻な表現型を開発。髄鞘形成におけるMBPのこの重要な役割は、in vitroおよびin vivo 11 の両方のオリゴデンドロサイト分化のマーカーとしての使用につながっています。

MBPの定量化は、いくつかの異なる方法を用いて達成することができます。 RT-PCRおよびウェスタンブロット分析は、異なる治療計画の下MBPレベルの定量化を可能にします。免疫細胞化学は、カメラベースの顕微鏡手法が使用される場合にも、定量的であることができる共通の定性的なアプローチです。これらのシステムは、信頼性との基本であるが、オリゴデンドロサイト分化の研究では、それぞれが薬物スクリーニングにおけるそれらの使用を制限し、自分の欠点を有しています。まず、RT-PCRおよびウェスタンブロット分析のために必要とされる主要なOPCの量を同時に検査することができる変数の数を減少させます。免疫細胞化学のための細胞要件がはるかに低いですが定量化が目標である場合には、かなりの時間が各実験に専念しなければなりません。多数の画像が取り込まれ、その後、実験的な分析を容易にするために、定量化する必要があります。これらの注意事項は、高スループットの評価を必要とする研究のために考慮すべき重要な障害となります。ここでは、大幅に必要な細胞の数および定量分析が完了するまでの時間の両方を削減しながら、免疫細胞化学およびミエリン定量化のためのウェスタンブロット方法論の両方から基本的な側面を利用する方法について説明します。

Protocol

動物を対象とする手順は、施設内動物管理使用委員会(IACUC)と医学のジョンズ・ホプキンス大学によって承認されています。 1.アッセイプレートの調製、ストックソリューション、およびOPCベースメディア注:ここで説明したラットOPCベース(佐藤)メディアは、以前に公開された研究12,13から導出されています。代替的な培地処方は、この手順と適合性であってもよいで…

Representative Results

A2B5陽性のOPCは、磁気カラム分離システムを使用して陽性細胞の選択によって単離されます。単離手順の前に、全脳はP5とP7の間にあるラットの子から削除されます。全脳を正常頭蓋骨から取り外されると、嗅球および小脳微細手術用鉗子( 図1A)を使用して除去されます。大脳皮質組織を単離するために視床下部、視床と中脳を慎重に解剖( 図1B)…

Discussion

ここで紹介するプロトコルは、ラットのOPCを単離し、実験的な要因に応じて、 試験管 oligodendrogenesis 定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を記載しています。正の選択を使用して、実行可能な、純粋なOPCの高い収率を実験目的のために直接使用されています。この方法は、1週間の時間枠に分離、培養、および分化工程を合理化し、固定された細胞は、好都合には、アッ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

グラントスポンサー:国立衛生研究所。グラント番号:R37 NS041435。

Materials

Dissection Materials
PBS without Ca2+ and Mg2+ Mediatech 21-040-CV 1 x
10 cm Polystyrene Petri Dishes Fisherbrand 0857512
Light Dissection Microscope Motic SM2-168
Dissociation Materials
Tube Rotator Miltenyi Biotec 130-090-753 Dissociation Tube Rotator
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Enzymatic Dissociation Kit
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1 x
40 μm Cell Strainer Corning 352340
A2B5 Column Purification 
Anti-A2B5 Microbeads Miltenyi Biotec 130-097-864 Bead Bound A2B5 Antibody
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 Magnetic Selection Columns
EDTA Corning 46-034-Cl 2mM
PBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 20-030-CV 1 x
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9647 0.50%
Culture Materials
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 20 ng/mL
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D2650 Hybri-Max 100 mL
Triiodothyronine  Sigma-Aldrich T6397 45 nM
Clemastine fumarate salt Sigma-Aldrich SML0445-100MG 1 μM
Quetiapine hemifumarate salt Sigma-Aldrich Q3638-10MG 1 μM
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165 5 μg/mL
Progesterone Sigma-Aldrich P8783 60 ng/mL
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524 10 μg/mL
Putrecine Sigma-Aldrich P7505 16 μg/mL
Sodium Selenite Sigma-Aldrich S5261 40 ng/mL
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0135 50 ng/mL
d-Biotin Sigma-Aldrich B4639 10 ng/mL
Insulin Sigma-Aldrich I6634 5 μg/mL
Apo-Transferrin Sigma-Aldrich T1147 100 μg/mL
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A4161 100 μg/mL
Trace Elements B Corning 25-022-Cl 1 x 
B-27 Supplement Life Technologies 17504044 1 x 
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140122 1 x 
DMEM Life Technologies 11995-065 1 x 
24-well Black Visiplate with lid Perkin Elmer 1450-605 Tissue culture grade
Immunocytochemistry and Quantification
PFA Sigma-Aldrich 100-13A 4%
Triton X-100 Sigma-Aldrich 78787 0.10%
Normal Goat Serum Jackson Immuno Research 005-000-121 5%
mouse monoclonal anti-MBP Biolegend SMI-99P 1:1000 Dilution
rabbit polyclonal anti-Actin Santa Cruz Biotecnology SC-7210 1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2 Millipore AB9610 1:1000 Dilution
goat anti-mouse 680RD Licor 926-68070 1:500 Dilution
goat anti-rabbit 800CW Licor 926-32211 1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse Life Technologies A11032 1:000 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit Life Technologies A11008 1:000 dilution
Prolong Gold antifade with DAPI Life Technologies P36931
DPBS with Ca2+ and Mg2+ Corning 21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System Licor

References

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Schott, J. T., Kirby, L. A., Calabresi, P. A., Baxi, E. G. Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning. J. Vis. Exp. (108), e53764, doi:10.3791/53764 (2016).

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