Framställning av råtta Oligodendrocyte gångar kulturer och kvantifiering av Oligodendrogenesis Med dubbla infraröd fluorescens Scanning
Summary
Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.
Abstract
Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.
Introduction
Effektiv nervledning i det centrala nervsystemet hos däggdjur (CNS) kräver myelinisering av axoner genom oligodendrocyter. Under utveckling, oligodendrocyter härrör från en pool av oligodendrocyt progenitorceller (OPCs) som är tänkt att migrera från kammarzoner utvecklingshjärnan och neuralrörsdefekter en. Efter migrations OPCs differentiera till mogna, myeliniserande oligodendrocyter som inte bara underlätta en effektiv impuls förökning, men också ge axoner med trofiska stöd 2. Den vuxna CNS upprätthåller en riklig population av OPCs som är spridda över hela grå och vit substans som innefattar cirka 5-8% av alla celler 3. Efter en demyeliniserande förolämpning, OPCs migrera till platsen för skadan, föröka sig och differentiera att ersätta förlorade eller skadade myelinskidorna på utsatta axoner. Men i vissa inställningar sjukdom / skada, är denna process visar sig vara ineffektiva eller kan misslyckas helt 4. Medankronisk demyelinisering tros lägga till sjukdomsbördan, effektiv oligodendrogenesis och remyelinisering kan lindra symtomen 5. Det har därför varit av intresse att studera OPCs in vitro för att bestämma effekten av experimentella faktorer på oligodendrogenesis.
Insikt i de olika faserna av oligodendrocyt differentiering har möjliggjorts genom att identifiera scenen specifika cellmarkörer. Självförnyande tidiga progenitorceller definieras genom deras uttryck av blodplättshärledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα), neurala / glia antigen 2 (NG2) och A2B5 6-8. Som OPC initiera deras differentiering program och dra sig tillbaka från cellcykeln, de nedreglera uttryck av dessa markörer och börjar uttrycka proteiner indikerar premyelinating oligodendrocyter inklusive cyklisk nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNPase) och O4. Slutligen deras differentiering till mognare oligodendrocytes kännetecknas av uttrycket av myelinassocierade proteiner, inklusive myelinassocierat glykoprotein (MAG), proteolipidprotein (PLP), och myelingrundprotein (MBP). MBP är en intracellulär perifert membranprotein och en huvudkomponent i myelinskidan. Möss som saknar MBP utvecklar en allvarlig fenotyp där CNS myelination signifikant minskade leder till skakningar, kramper och tidig död 9,10. Denna viktiga roll MBP i myeline har lett till dess användning som en markör för oligodendrocyt differentiering både in vitro och in vivo 11.
Kvantifiering av MBP kan uppnås med hjälp av flera olika metoder. RT-PCR och Western blot-analys medger kvantifiering av MBP-halter under olika behandlingsregimer. Immunocytokemi är en gemensam kvalitativ metod som också kan vara kvantitativ när kamerabaserade mikroskopi metoder används. Även om dessa system är tillförlitliga och grundläggande förstudiet av oligodendrocyt differentiering, de har alla sina egna nackdelar som begränsar deras användning i läkemedelsscreening. Första, Mängden primära OPCs som behövs för RT-PCR och Western blot-analys reducerar antalet variabler som kan granskas samtidigt. Medan kravet cell för immuncytokemi är mycket lägre, måste avsevärd tid ägnas åt varje experiment om kvantifiering är målet. Ett stort antal bilder måste fångas och sedan kvantifieras för att underlätta experimentell analys. Dessa varningar blivit viktiga hinder att tänka på för studier som kräver hög genomströmning bedömning. Här beskriver vi en metod som utnyttjar grundläggande aspekter från både immunocytokemi och Western blot-metoder för myelin kvantifiering, och samtidigt avsevärt minska både antalet celler som krävs och tid för att slutföra en kvantitativ analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här beskriver en snabb och pålitlig metod för att isolera rått OPCs och kvantifiera in vitro oligodendrogenesis som svar på experimentella faktorer. Med användning av positiv selektion, är höga utbyten av viabla och rena OPCs användes direkt för försöksändamål. Denna metod förenklar isolering, odling och differentiering steg till en 1 vecka tidsram, och fixerade celler kan lämpligen lagras vid 4 ° C under flera veckor utan någon förlust i analyskänslighet.
<p …Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant sponsor: National Institutes of Health, Licensnummer: R37 NS041435.
Materials
| Dissection Materials | |||
| PBS without Ca2+ and Mg2+ | Mediatech | 21-040-CV | 1 x |
| 10 cm Polystyrene Petri Dishes | Fisherbrand | 0857512 | |
| Light Dissection Microscope | Motic | SM2-168 | |
| Dissociation Materials | |||
| Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | Dissociation Tube Rotator |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Enzymatic Dissociation Kit |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| 40 μm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| A2B5 Column Purification | |||
| Anti-A2B5 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-097-864 | Bead Bound A2B5 Antibody |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Magnetic Selection Columns |
| EDTA | Corning | 46-034-Cl | 2mM |
| PBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 20-030-CV | 1 x |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | 0.50% |
| Culture Materials | |||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 20 ng/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | Hybri-Max 100 mL |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T6397 | 45 nM |
| Clemastine fumarate salt | Sigma-Aldrich | SML0445-100MG | 1 μM |
| Quetiapine hemifumarate salt | Sigma-Aldrich | Q3638-10MG | 1 μM |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 5 μg/mL |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | 60 ng/mL |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | 10 μg/mL |
| Putrecine | Sigma-Aldrich | P7505 | 16 μg/mL |
| Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 40 ng/mL |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0135 | 50 ng/mL |
| d-Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 ng/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 5 μg/mL |
| Apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T1147 | 100 μg/mL |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4161 | 100 μg/mL |
| Trace Elements B | Corning | 25-022-Cl | 1 x |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | 1 x |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 1 x |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | 1 x |
| 24-well Black Visiplate with lid | Perkin Elmer | 1450-605 | Tissue culture grade |
| Immunocytochemistry and Quantification | |||
| PFA | Sigma-Aldrich | 100-13A | 4% |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 78787 | 0.10% |
| Normal Goat Serum | Jackson Immuno Research | 005-000-121 | 5% |
| mouse monoclonal anti-MBP | Biolegend | SMI-99P | 1:1000 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Actin | Santa Cruz Biotecnology | SC-7210 | 1:200 Dilution |
| rabbit polyclonal anti-Olig2 | Millipore | AB9610 | 1:1000 Dilution |
| goat anti-mouse 680RD | Licor | 926-68070 | 1:500 Dilution |
| goat anti-rabbit 800CW | Licor | 926-32211 | 1:500 Dilution |
| Alexa Fluor 594 goat anti-mouse | Life Technologies | A11032 | 1:000 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit | Life Technologies | A11008 | 1:000 dilution |
| Prolong Gold antifade with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | Corning | 21-030-CV | |
| Licor Odyssey Clx Infared Imaging System | Licor | ||
References
- Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification. Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).
- Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS. Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).
- Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity. Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).
- Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).
- Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain. J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).
- Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells. Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).
- Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve. Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).
- Popko, B., et al. Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin. Cell. 48 (4), 713-721 (1987).
- Bourre, J. M., et al. Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation. J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).
- Baxi, E. G., et al. A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation. Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).
- Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system. Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).
- Warringa, R. A., et al. Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures. Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).
- Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes. J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).
- Xiao, L., et al. Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes. Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).
- Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).
- Deshmukh, V. A., et al. A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis. Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).
- Najm, F. J., et al. Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo. Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).
- Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
- O’Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues. J Vis Exp. (54), (2011).
- Dugas, J. C., Emery, B. Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).
- Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).
