Een verbeterde werkwijze voor snelle intubatie van de trachea in muizen
Summary
Dit artikel presenteert een snelle en eenvoudige methode voor het toedienen van bleomycine rechtstreeks in de muis luchtpijp via intubatie. Belangrijkste voordelen van deze werkwijze zijn dat het zeer reproduceerbaar, gemakkelijk onder de knie, en vereist geen gespecialiseerde apparatuur of lange hersteltijden.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
Ondanks sommige anatomische en fysiologische verschillen, 1 muismodellen verder waardevol voor het modelleren van de menselijke biologie en pathogenese. 2 Vanuit husbandry oogpunt te zijn, muizen gemakkelijk te hanteren, een lage broedtijd, een versnelde levensduur en zijn relatief goedkoop naar huis. Met de ontwikkeling van verschillende genetische stammen en strategieën (bv., Conditioneel knock-outs, reporter muizen-lineage tracing benaderingen, enz.), Alsook de vele beschikbare reagentia (bijv., Antilichamen, recombinante eiwitten, remmers, etc.), zijn muizen een essentieel model gewerveld organisme menselijke homeostase en ziekteprocessen ontdekken geworden. 3
Muizen zijn bijzonder waardevol voor het bestuderen longaandoeningen, waaronder acute longbeschadiging (ALI) en pulmonale fibrose. 4 ALI bij mensen kan worden veroorzaakt door trauma, verwonding of sepsis en wordt gekenmerkt door epitheliale enendotheliale lek (bv., oedeem), ontsteking en ontluikende fibrose. Bij veel patiënten ALI ontwikkelt tot de ernstige vorm, acute respiratory distress syndrome (ARDS), wat vaak leidt tot fibrose en dood door respiratoir falen. 5,6 Longfibrose is een progressieve, fatale pathologie gekenmerkt door de overmatige depositie van extracellulaire matrix , met name type I collageen, wat leidt tot verminderde longfunctie. 7,8 Toediening van bleomycine (BLM) is de meest gebruikte en best gekarakteriseerde voorbeeld voor het induceren van ALI en fibrose bij proefdieren. 9 Hoewel BLM-geïnduceerde longfibrose bij knaagdieren doet herhalen niet volledig menselijke fibrotische fenotypes, 10 muizenstudies met dit model hebben geleid tot de ontdekking van vele belangrijke factoren beïnvloeden het ontstaan en de progressie van ziekte. 11
Hoewel de exacte mechanisme (s) achter BLM geïnduceerde fibrogenese onbekend zijn, het initiëren van letselwordt gedacht dat het gevolg zijn van contact-afhankelijke DNA-breuken in de epitheelcellen die de geleidende luchtwegen en longblaasjes, en in het bijzonder type 1 pneumocyten. 12 De behoefte aan direct contact tussen BLM en de pulmonaire epitheel benadrukt het belang van een robuuste levering route en deze zorgen ook relevant voor een breed scala aan behandelingen gericht op het distale luchtwegen, waaronder recombinante proteïnen, antilichamen, siRNA, virussen, bacteriën, deeltjes, en meer. Orofaryngeale aspiratie (OPA) wordt algemeen gebruikt voor dit doel 13, maar een belangrijke tekortkoming van OPA is dat een gedeelte van het geleverde middel kan worden ingenomen in het maagdarmkanaal, hetgeen leidt tot onnauwkeurigheid in de toegediende dosering. Een andere veel gebruikte benadering is transtracheaal instillatie, die tracheostomie gaat onder zware verdoving de luchtpijp en instillatie van een middel bloot direct in de luchtwegen. 14 echter niet alleen kan een dergelijkeeen procedure ongewenst vanwege de invasiviteit, maar het is ook tijdrovend, vereist nogal wat training en veroorzaakt een sterke schade aan het ademhalingskanaal. 15,16 Verscheidene protocollen ontwikkeld die de directe toediening van agentia kan voordoen in de trachea zonder chirurgische ingreep, 16,17,18,19,20 maar deze werkwijzen omvatten verlengde herstelperiode door krachtige anesthetica, het gebruik van dure apparatuur (bijv., otoscope / laryngoscoop handel verkrijgbare procedure boards, fiber-optic draden, etc.), een overmaat van manipulatie in de mondholte en onzekerheid over de dosering.
Dit document beschrijft een relatief eenvoudige methode van toediening via intubatie die het mogelijk maakt een onderzoeker snel, goedkoop en betrouwbaar inboezemen een reagens in de muizen long met een beperkt risico van de resterende schade aan de omliggende weefsels.
Protocol
Representative Results
Discussion
In gevallen waarin aërosol onpraktisch vanwege beperkte reagens beschikbaarheid, veiligheid, kosten of directe toediening trachea is een superieure werkwijze voor het afgeven van exogene middelen in de longen 16 transtracheale instillatie is op grote schaal gebruikt om dit te bereiken.; Zoals bij alle chirurgische ingreep, maar houdt ook de kans op complicaties als gevolg van de procedure zelf, en niet noodzakelijkerwijze het middel dat wordt ingeprent. 13 Daarom is het steeds g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Brian Johnson van de histologie en Imaging Core aan de Universiteit van Washington voor hulp met de trichroomkleuring en analyse. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies HL098067 en HL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis – preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. d. R., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. d. S. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
