Um método melhorado para rápida de intubação da traqueia em Ratos
Summary
Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.
Abstract
Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.
Introduction
Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, 1 modelos murino continuam a ser de valor inestimável para a modelagem de biologia humana e patogênese da doença. 2 Do ponto de vista pecuária, os ratos são fáceis de manusear, tem um tempo de reprodução baixa, um tempo de vida acelerado, e são relativamente baratos para abrigar. Com o desenvolvimento de diversas estirpes genéticas e estratégias (por ex., Condicionais knock-outs, ratinhos repórter, abordagens de rastreio de linhagem, etc.), bem como a grande variedade de reagentes disponíveis (por exemplo., Anticorpos, proteínas recombinantes, inibidores, etc.), os ratos se tornaram um organismo essencial modelo de vertebrados para descobrir processos de homeostase e de doenças humanas 3.
Os ratos têm sido especialmente valiosa para estudar as condições pulmonares, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e fibrose pulmonar. 4 LPA em seres humanos pode ser causado por trauma, lesão, ou septicemia e é caracterizada por células epiteliais evazamento endotelial (isto é., edema), inflamação e fibrose nascente. Em muitos pacientes, ALI progride para sua forma grave, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), que muitas vezes resulta em fibrose e morte por insuficiência respiratória. 5,6 fibrose pulmonar é uma patologia progressiva, fatal caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular , digite mais notavelmente I colágeno, levando a função pulmonar prejudicada. 7,8 a administração de bleomicina (BLM) é o modelo mais amplamente utilizado e melhor caracterizado para induzir ALI e fibrose em animais experimentais. 9 Apesar de fibrose pulmonar BLM-induzida em roedores faz não recapitular plenamente os fenótipos fibróticas humanos, 10 estudos com ratos com este modelo levaram à descoberta de muitos fatores importantes que influenciam o aparecimento e progressão da doença 11.
Enquanto o mecanismo exacto (s) por detrás fibrogénese induzida por BLM são desconhecidas, a lesão iniciarPensa-se que surgir a partir de rupturas dos filamentos de DNA dependente de contacto nas células epiteliais que revestem as vias aéreas condutoras e alvéolos e, em particular, tipo 1 pneumócitos. 12 A necessidade de contacto directo entre BLM eo epitélio pulmonar destaca a importância de uma rota de entrega robusta , e estas preocupações são também pertinentes para uma vasta gama de tratamentos direccionado para as vias respiratórias distais, incluindo proteínas recombinantes, anticorpos, siRNA, vírus, bactérias, partículas, e mais. Aspiração orofaríngea (OPA) tem sido amplamente utilizado para este fim 13, mas um grande inconveniente de uma OPA é que alguma porção do agente fornecido pode ser engolida para o tracto gastrointestinal, conduzindo assim a imprecisão na dose administrada. Outra abordagem amplamente utilizada é a instilação transtraqueal, que envolve traqueostomia sob anestesia forte para expor a traqueia e a instilação de um agente directamente no tracto respiratório. 14 No entanto, tal não só podeum procedimento ser indesejável devido ao seu invasividade, mas também consome tempo, exige um pouco de formação, e provoca uma lesão potente ao tracto respiratório têm sido desenvolvidos. 15,16 Vários protocolos que envolvem a administração directa de agentes para o traqueia, sem a necessidade de intervenção cirúrgica, 16,17,18,19,20 tempos de recuperação, mas estes métodos envolvem estendidos causada pelos anestésicos potentes, o uso de equipamento caro (isto é., otoscope / laringoscopio, disponíveis comercialmente placas de procedimento, de fibra óptica fios, etc.), um excesso de manipulação na cavidade oral, e a incerteza sobre a dosagem.
Este artigo descreve um método relativamente fácil de administração por entubação que permite que um investigador de forma rápida, barata, e infundir de forma fiável um reagente para o pulmão de murino com o risco reduzido de danos residuais para os tecidos circundantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nos casos em que aerossolização é impraticável devido à disponibilidade limitada de reagentes, de segurança, ou de custos, a administração traqueal directa é um método superior para a entrega de agentes exógenos aos pulmões 16 transtraqueal instilação tem sido amplamente utilizada para realizar isto.; No entanto, como acontece com qualquer intervenção cirúrgica, ele também carrega consigo o potencial de complicações causadas pelo procedimento em si, e não necessariamente o agente a ser in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem Brian Johnson da Histologia e imagem Núcleo da Universidade de Washington para obter ajuda com a coloração tricromo e análise. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL098067 e HL089455.
Materials
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | N/A | N/A | |
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 mL Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2ml Pipettor and Filter Tips | N/A | N/A | |
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | N/A | N/A | See Diagram 1. |
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | N/A | N/A | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | N/A | http://www.highlandmedical.net/ |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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