Isolatie van CD146⁺ Resident Lung mesenchymale stromale cellen van Rat Longen

Summary

Dit protocol beschrijft een isolatietechniek voor het verkrijgen van primaire long resident mesenchymale stromale cellen van ratten, door middel van enzymatische digestie, dichtheidsgradiënt scheiding plastic hechting en CD146 ⁺ magnetische bead selectie.

Abstract

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Bovendien hebben ze waarschijnlijk een rol bij normale orgaanontwikkeling en zijn toegewezen rol in ziekte, met name die met een fibrotische aard. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen. De isolatie techniek die hier beschreven geldt meerdere kenmerken van de long resident MSC's (L-MSC). Bij het offer van de ratten, zijn longen verwijderd en gespoeld meerdere keren om bloed te verwijderen. Naar aanleiding van mechanische dissociatie door scalpel, worden de longen verteerd gedurende 2-3 uur met behulp van een mix van het type collagenase I, neutraal protease en het type DNase I. De obtained enkele celsuspensie wordt vervolgens gewassen en gelaagd over dichtheidsgradiënt medium (dichtheid 1,073 g / ml). Na centrifugatie worden cellen uit de interfase gewassen en uitgeplaat in kweek behandelde flessen. Cellen worden gekweekt gedurende 4-7 dagen in fysiologische _5% O2, 5% CO ₂ condities. Om fibroblasten (CD146 ^-) afbreken en een bevolking van slechts L-MSC's (CD146 ^+), positieve selectie voor CD146 ⁺ cellen te waarborgen wordt uitgevoerd door middel van magnetische bead selectie. Samengevat, deze procedure levert betrouwbare een populatie van primaire L-MSC's voor verdere in vitro onderzoek en manipulatie. Vanwege de aard van het protocol, kan het gemakkelijk worden vertaald naar andere experimentele diermodellen.

Introduction

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) worden steeds meer erkend voor hun therapeutisch potentieel in een groot aantal ziekten, waaronder longziekten. Naast het gebruik van beenmerg en navelstreng MSC's voor exogene celtherapie, wordt er ook steeds meer belangstelling voor de reparatie en het regeneratieve potentieel van ingezeten weefsel MSC's. Tijdens de ontwikkeling, waaronder de longen, het mesenchym is een belangrijke bron van ontwikkelings signalen en resident MSCs een waarschijnlijke kandidaat te zijn in het midden van dit. Bovendien is het bewijs in opkomst die inwoner MSC's worden verstoord bij volwassen ziekten, waaronder kanker ^1,2 en fibrose ^3. De belangrijkste belemmering voor de studie van deze resident weefsel MSCs is het ontbreken van een duidelijke markering voor de isolatie en identificatie van deze cellen ^4. Stamcel antigeen-1 (Sca-1) werd geïdentificeerd bij muizen als een marker voor een verscheidenheid van weefsels stamcellen, en kan worden gebruikt voor de isolatie van L-MSC ^5, maar heeft helaasgeen bekende orthologen uit andere soorten ^6. Onderzoekers hebben een verschillende isolatiemethoden voor de isolatie van L-MSC's van ofwel longweefsel of vloeibare gerapporteerd. Deze variëren van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde methodes selecteren op CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ cellen ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epitheliale cel adhesiemolecuul (EpCAM) – / Sca-1 + -cellen ^8, multidrug resistentie transporter ATP bindende cassette G (ABCG2) positieve cellen ^{9 of} Hoechst 33342 kleurstof efflux ^10, kunststof hechting ^11,12 en migratie uit gehakt weefsel ^13.

De voordelen van de hierin voorgestelde werkwijze zijn meervoudig. Door middel van een zachte enzymatische digestie en dichtheidsgradiënt ^14, verkrijgt men alle cellen van het dichtheidbereik dat MSC's omvatten maar exclusief epitheel- en endotheelcellen. De daaropvolgende plastic hechting maatregel wordt bereikt dat alleen de mesenchymal cellen hechten en verblijf in de cultuur, waardoor leukocyten. Belangrijker echter, de CD146 ⁺ selectiestap maakt de eliminatie van fibroblasten, aangezien deze cellen niet CD146 tot expressie. Expressie van de celadhesie molecuul CD146 is positief gecorreleerd met multipotentie, en is daarom een goede marker om onkruid uit fibroblasten van een mesenchymale celpopulatie ^15-19. Dit is een voordeel boven het gebruik van CD90 als een selectiemerker, omdat het niet alleen uitgedrukt in MSC's maar ook in lipofibroblasts ^5,20. In dit protocol hebben we nadrukkelijk gekozen voor een magnetisch bolletje selectie, omdat het zachter op de cellen, en de gehele procedure kan worden uitgevoerd in steriele omstandigheden. Een ander belangrijk voordeel van deze isolatiemethode in plaats van de uitgroei methode is dat het relatief snel, 6-10 dagen in tegenstelling tot een maand of meer voor de uitgroei methode. Drie tot vijf dagen na de oorspronkelijke isolatie de mesenchymale populatie is gereed voor CD146 ⁺ sele ction; Na nog drie tot vijf dagen de CD146 ⁺ cellen direct worden gebruikt voor experimenten of kan worden ingevroren voor later gebruik. De verminderde tijd cultuur verbetert de kwaliteit van de cellen als MSCs transdifferentiëren richting fibroblasten verlengde ex vivo kweken ^19. Tenslotte vanwege de aard van het protocol, is het mogelijk om deze methode toe te passen op andere soorten door simpelweg geschikte antilichamen te kiezen of zelfs andere orgaansystemen door aanpassing van de keuze van verteringsenzymen en incubatietijd.

Een gedetailleerd protocol van deze isolatiewerkwijze wordt hieronder gegeven, en een schematisch overzicht van de isolatie en daaropvolgende selectie van de CD146 ⁺ subpopulatie wordt respectievelijk gegeven in Figuur 1A en 1B. Bovendien worden gegevens welke voor passage, invriezen en ontdooien van deze cellen.

ad / 53782 / 53782fig1.jpg "/>
Figuur 1. Schematisch overzicht van de isolatie van pulmonale mesenchymale cellen (A) en daaropvolgende CD146 ⁺ celselectie (B) min = minuten.; EDTA = Ethyleendeniaminetetraacetaat; ² e Ab = secundair antilichaam; a-CD146 Ab = primaire anti-CD146 antilichaam; ve cellen = CD146 negatieve cellen; + ve cellen = CD146 positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa (dierethiek protocol OHRI-1696). Dierenzorg werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen. 1. Isolatie van Lung mesenchymale stromacellen Bereid het enzym mix in een 50 ml tube: wegen 30 U neutraal protease, 2500 AL Collagenase I en 500 U DNAse I. Deze bedragen volstaan ​​voor de longen van een volwassen muis of rat pup. Bereid op dag van isolatie en bewaar bij 4 ° C tot gebru…

Representative Results

Twee van de meest betrouwbare fysische eigenschappen van MSCs, dichtheid en kunststof hechting, worden in het eerste deel van dit protocol om de mesenchymale celfractie van de long die L-MSC's bevat te verkrijgen. Hoewel de dichtheidsgradiënt interfase omvat monocyten en macrofagen naast long mesenchymale cellen, de plastic hechting gevolgd door 3-5 dagen kweken zorgt ervoor dat alleen de long mesenchymale cellen blijven. Inderdaad deze celpopulatie drukt de klassieke MSC oppervlak …

Discussion

De isolatie en de cultuur van primaire L-MSC's biedt een kans om hun functie en hun interactie met andere celpopulaties op cellulair niveau, en hun rol in de ontwikkeling van de longen, gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Dit is vooral belangrijk omdat het ontbreken van één specifieke marker van deze cellen maakt het bijna onmogelijk om deze cellen te bestuderen in situ. Zoals bij alle primaire cel populaties, moet men in gedachten houden dat deze cellen meer kans om hun karakter te veranderen hoe la…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC