Isolierung von CD146⁺ Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 ⁺ magnetisches Kügelchen Auswahl.

Abstract

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Darüber hinaus haben sie wahrscheinlich eine Rolle bei der normalen Organentwicklung und haben Rollen in Krankheit zugeschrieben worden, insbesondere solche mit einer fibrotischen Natur. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen. Die Isolierung hier beschriebene Technik gilt mehrere Merkmale von Lungen ansässig MSCs (L-MSCs). Nach Opfer der Ratten, sind Lunge entfernt und mehrmals gewaschen, um Blut zu entfernen. Folgende mechanische Dissoziation von Skalpell werden die Lungen für 2-3 Stunden mit einer Mischung aus Collagenase Typ I, neutrale Protease und DNase Typ I. Die obtaine verdautd Einzelzellsuspension wird anschließend gewaschen und überlagert über Dichtegradienten-Medium (Dichte 1,073 g / ml). Nach der Zentrifugation werden die Zellen aus der Zwischenphase gewaschen und in Kulturflaschen behandelt plattiert. Die Zellen werden für 4-7 Tage in physiologischer 5% O _{2, 5% CO 2} Bedingungen. Zu verarmen Fibroblasten (CD146 ^-) und eine Bevölkerung von nur L-MSCs (CD146 ^+), die positive Selektion für CD146 ⁺ Zellen gewährleistet ist, durch magnetische Perle Auswahl durchgeführt. Zusammenfassend ergibt dieses Verfahren zuverlässig eine Bevölkerung von Primär L-MSCs für weitere in vitro-Studie und Manipulation. Aufgrund der Natur des Protokolls kann es leicht zu anderen experimentellen Tiermodellen übersetzt werden.

Introduction

Mesenchymalen Stromazellen (MSCs) werden zunehmend für ihr therapeutisches Potential in einem weiten Bereich von Krankheiten erkannt, einschließlich Lungenerkrankungen. Neben der Verwendung von Knochenmark und Nabelschnurblut MSCs für exogene Zelltherapie wird auch ein zunehmendes Interesse an der Reparatur und regenerative Potenzial ansässig Gewebe MSCs. Während der Entwicklung, unter anderem in der Lunge ist das Mesenchym eine wichtige Quelle für Entwicklungsanzeichen und Bewohner MSCs sind ein aussichtsreicher Kandidat in der Mitte davon zu sein. Darüber hinaus wird immer mehr Anzeichen dafür, dass die Bewohner MSCs bei erwachsenen Krankheiten gestört werden, einschließlich Krebs ^1,2 und Fibrose ^3. Die größte Hürde für das Studium dieser ansässig Gewebe MSCs ist das Fehlen einer klaren Marker für die Isolierung und Identifizierung dieser Zellen ^4. Stammzell-Antigen-1 (Sca-1) wurde in Mäusen als Marker für eine Vielzahl von Gewebestammzellen identifiziert und können für die Isolierung von L-MSCs ⁵ verwendet werden, hat aber leider⁶ Orthologe in anderen Spezies nicht bekannt. Forscher haben eine Vielzahl von verschiedenen Isolationsverfahren für die Isolierung von L-MSCs entweder von Lungengewebe oder Flüssigkeit berichtet. Diese reichen von Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) basierte Verfahren für CD31 Auswahl ^– / CD45 ^– / CD90 ⁺ Zellen ^7, CD31 ^– / CD45 ^– / epithelialen Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) – / Sca-1 + Zellen ^8, Multidrug-Resistenz-Transporter ATP-Bindungskassette G (ABCG2) positive Zellen ^{9 oder} Hoechst 33342 Farbstoff Auslauf ^10, Kunststoffadhärenz ^11,12 und Migration von zerkleinerten Gewebes ^13.

Die Vorteile der hier vorgestellten Verfahren sind mehrfach. Durch die Verwendung von ¹⁴ eine sanfte enzymatische Verdauung und Dichtegradienten erhält man alle Zellen des Dichtebereichs, die MSCs gehören, epithelialen oder endothelialen Zellen auszuschließen. Die anschließende Kunststoffadhärenz Schritt stellt sicher, dass nur die mesenchymal Zellen anhaften und in der Kultur bleiben, Leukozyten zu beseitigen. Vor allem aber erlaubt die CD146 ⁺ Selektionsschritt zur Beseitigung von Fibroblasten, da diese Zellen nicht CD146 exprimieren. Die Expression des Zelladhäsionsmolekül CD146 positiv mit Multipotenz korreliert, und ist daher eine gute Markierung Fibroblasten aus einer mesenchymalen Zellpopulation ^15-19 auszusondern. Dies ist ein Vorteil gegenüber CD90 als Selektionsmarker verwendet, da sie nicht nur in MSCs exprimiert wird, sondern auch in lipofibroblasts ^5,20. In diesem Protokoll haben wir ausdrücklich ein magnetisches bead Auswahl gewählt, da es auf die Zellen sanfter ist, und die gesamte Prozedur kann unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Ein weiterer wichtiger Vorteil dieses Isolierungsverfahren wie zum Auswachsen Verfahren gegenüber, ist, dass es relativ schnell ist, als 6-10 Tage bis zu einem Monat oder mehr für den Auswuchs Verfahren gegenüber. Drei bis fünf Tage nach der ersten Isolierung der mesenchymalen Bevölkerung ist bereit für CD146 ⁺ Sele ction; Nach weiteren drei bis fünf Tagen die CD146 ⁺ Zellen sind bereit für Experimente verwendet werden oder kann für eine spätere Verwendung eingefroren werden. Die verringerte Zeit der Kultur verbessert die Qualität der Zellen als MSCs transdifferentiate Richtung Fibroblasten in Kultur verlängert ex vivo ^19. Schließlich wegen der Art des Protokolls ist es möglich, dieses Verfahren auf andere Arten anzuwenden, indem einfach geeignete Antikörper oder sogar auf andere Organsysteme Auswahl durch die Wahl der Verdauungsenzyme und Inkubationszeit eingestellt wird.

Ein detailliertes Protokoll dieser Isolierungsmethode ist unten angegeben, und eine schematische Übersicht über die Isolierung und anschließende Auswahl der CD146 ⁺ Subpopulation ist in 1A und 1B vorgesehen. Zusätzlich werden Details für die Passage enthalten, Einfrieren und diese Zellen aufgetaut.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung von Lungen mesenchymalen Zellen (A) und die anschließende CD146 ⁺ Zellauswahl (B) min = Minuten. EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure; ^2. Ab = Sekundärantikörpers; a-CD146 Ab = primäre anti-CD146-Antikörper; & ndash; ve Zellen = CD146-negativen Zellen; + ve Zellen = CD146-positiven Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

Alle Verfahren wurden von der Animal Care Committee der University of Ottawa (Tierethik Protokoll Ohri-1696) zugelassen. Tierbetreuung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts durchgeführt. 1. Isolierung von Lung mesenchymalen Stromazellen Bereiten Sie die Enzymmischung in einer 50 ml Tube: wiegen 30 U neutrale Protease, 2.500 U Kollagenase I und 500 U DNAse I. ausreichen Diese Beträge für die Lunge eines erwachsenen Maus oder Ratte Welpen. Bereiten Sie am Tag der Isolierung…

Representative Results

Zwei der zuverlässigsten physikalischen Eigenschaften von MSCs, Dichte und Kunststoffadhärenz werden im ersten Teil dieses Protokolls verwendet, um die mesenchymale Zellfraktion der Lunge zu erhalten, das L-MSCs enthält. Obwohl der Dichtegradient Interphase wird Monozyten und Makrophagen neben Lungen mesenchymalen Zellen, die Kunststoffadhärenz gefolgt von 3-5 Tagen Kultur gewährleistet sind, dass nur die Lunge mesenchymalen Zellen bleiben. Tatsächlich diese Zellpopulation drückt …

Discussion

Die Isolierung und Kultur von Primär L-MSCs stellt eine Chance zu einer besseren ihre Funktion und ihre Wechselwirkung mit anderen Zellpopulationen auf zellulärer Ebene zu verstehen und ihre Rolle in der Lungenentwicklung, Gesundheit und Krankheit. Dies ist besonders wichtig, da der Mangel an einem bestimmten einzigen Markierung dieser Zellen macht es nahezu unmöglich, diese Zellen in situ zu untersuchen. Wie bei allen primären Zellpopulationen, sollte man im Hinterkopf behalten, dass diese Zellen eher auf …

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC