이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 또한, 그들은 가능성이 정상 장기 발전에 역할을, 질병의 역할, 섬유 성 자연과 특히 때문이라고했다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물은 이러한 세포의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 여기에 설명 된 분리 기술은 폐 상주 중간 엽 줄기 세포 (L-중간 엽 줄기 세포)의 여러 특성을 적용합니다. 쥐의 희생에, 폐를 제거하고 혈액을 제거하기 위해 여러 번 세척한다. 메스에 의한 기계적 해리 후에, 폐 콜라겐 타입 I, 중성 프로테아제 및 DNase의 유형 I. obtaine의 혼합을 사용하여 2-3 시간 동안 소화D는 단일 세포 현탁액을 연속적으로 세척하고, 밀도 구배 배지 (밀도 1.073 g / ㎖) 위에 적층된다. 원심 분리 후, 계면에서 세포를 세척 및 문화 처리 된 플라스크에 도금. 세포는 생리 5 % O 2 4 내지도 7 일간 5 % CO 2 조건에서 배양했다. 섬유 아 세포 (CD146을 -) 고갈 및 CD146 + 세포 만 L-중간 엽 줄기 세포 (CD146 +), 긍정적 인 선택의 인구를 보장하기 위해 자기 비드 선택을 통해 수행된다. 요약하면,이 절차는 확실하게 더 시험관 연구와 조작을위한 기본 L-중간 엽 줄기 세포의 인구를 생성합니다. 때문에 프로토콜의 특성 때문에 용이하게 다른 실험 동물 모델로 변환 할 수있다.
서론
중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 개발하는 동안, 폐 비롯한 중간 엽 발달 큐의 중요한 원천이며, 거주자 엽 줄기 세포는이 중심에있을 가능성의 후보이다. 또한, 증거는 상주 중간 엽 줄기 세포가 암 1, 2, 3 섬유증을 포함한 성인병에 교란되는 부상하고있다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물이 셀 (4)의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 줄기 세포 항원 1 SCA (1)의 조직 줄기 세포의 다양한 마커로서 마우스에서 확인하고, L-5 엽 줄기 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 불행하게도 갖는다다른 종 6 orthologs은 알려진 바 없음. 연구팀은 폐 조직 또는 유체 중 하나에서 L-중간 엽 줄기 세포의 분리를위한 다른 분리 다양한 방법을보고했다. / CD45 - - / CD90 + 세포 (7), CD31 -<....
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프로토콜
모든 절차는 오타와 대학의 동물 관리위원회 (동물 윤리 프로토콜 OHRI-1696)에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다.
폐 중간 엽 기질 세포의 분리 (1)
- 50 ML 튜브에 효소 믹스를 준비 : 30 U 중립 프로테아제에 무게, 2,500 U 콜라게나 I 500 U DNase의 I.이 금액은 성인 마우스 또는 쥐 강아지의 폐 충분. 사용까지 4 ° C에서 분리 및 저장의 날 준비합니다.
- 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사 하루에 13에서 희생 쥐 새끼 (0.2 ㎖의 65 ㎎ / ㎖). 무의식을 설정 발가락 핀치 반사를 사용합니다. 아래에 설명 된대로 동물의 죽음은, 가슴을 열어 보장된다.
- 아주 조심하지되고, 70 % 에탄올로 동물을 분사하여 피부를 소독 조심스럽게 다이어프램에서 시작 주동이의 측면으로 절단 수술 가위를 사용하여 흉곽을 열폐를 손상시킬 수 있습니다. 가슴에 대한 액세스를 제공하기 위해 흉곽을 절단 대안 지혈 클램프를 사용하여 열려있는 흉곽 확산, 또는.
- 마음을 제거하여 동물에게서 피를 뽑다. 마음을 제거하려면, 작은 집게로 흉선과 마음을 잡고 수술 가위이를 절단. 더 이상 혈액이 절단 된 대동맥과 폐동맥 나오는 않을 때....
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결과
중간 엽 줄기 세포 밀도 및 플라스틱 접착의 가장 신뢰할 수있는 물리적 특성 둘, L-엽 줄기 세포를 포함하는 폐 중간 엽 세포 분획을 얻기 위해이 프로토콜의 첫번째 부분에서 사용된다. 밀도 구배 상간 폐 중간 엽 세포뿐만 아니라 단핵구 및 대 식세포를 포함 할 것이지만, 플라스틱 접착 배양 3-5 일까지 만 폐 중간 엽 세포 유지되도록 하였다. 실제로이 세포 인구는 고전 MSC 표면 마커 CD73, CD90 및 CD146을 표현하고 더 이상 어떤 백혈구 존재가 있음을 표시하지 마커 CD34, CD45, 주요 조직 적합성 복합체 유형 II (MHCII) -RT1B, CD11b를하고 CD79a에 대한 부정적 세포 집단 (도 2A). 관심 CD146 + 서브 세트에서, 44.4-65.7 %의 범위는 CD73 + 및 CD90 + (데이터는 도시하지 않음)는 것이다. 또한,이 세포 집단을.......
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토론
차 L-중간 엽 줄기 세포의 분리 및 배양은 더 나은 자신의 기능과 세포 수준에서 다른 세포 집단과의 상호 작용, 폐 개발, 건강과 질병에서의 역할을 이해 할 수있는 기회를 제공합니다. 이들 세포의 특정 단일 마커의 부족이 거의 불가능 반응계에서 이들 세포를 연구 할 수있다 이것은 특히 중요하다. 모든 기본 세포 집단과 마찬가지로, 하나는 이러한 세포들이 (24에서 검토) 문화 (19)에 보관되어 더 이상 자신의 캐릭터를 변경 가능성이 있음을 알아 두셔야합니다. 자연 상태에 가능한 한 가깝게 한 상태에서 L-엽 줄기 세포를 유지하기 위해, 그들은 37 ° C 가습 인큐베이터에서 5 % O 2, 5 % CO 2에서 배양하는 것이 매우 중요하다. 호흡 생리 일반적 분압 돌턴의 법칙에 기초하여, 주위 공기 (21 % O 2)의 산소 분압이 10 ~ 160 mmHg로, 그리고 방울 것을 수락폐포 영공 25-27<.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
JJPC는 캐나다 보건 연구소(CIHR) 박사후 연구원의 지원을 받습니다. MAM은 독일 국립 학술 재단(German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes)으로부터 성적 장학금을 받았으며 EFCNI(European Foundation for the Care of the Newborn Infant)의 보조금을 받습니다. BT는 CIHR, 캐나다 폐 협회(Canadian Lung Association), 줄기 세포 네트워크(Stem Cell Network) 및 이스턴 온타리오 아동 병원(Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute)의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | 격리 당일에 준비하고 4 °에 보관하십시오. C 사용 |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | 격리 일에 준비하고 4 °에 보관하십시오. 사용 |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | C 격리 당일에 준비하고 4°C에 보관하십시오. C 펜 |
| 토바르비탈 나트륨 (안타닐) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, | Ireland-Use | 0.2 ml for rat ppup 20-30 g; 더 큰 동물은 더 많이 필요할 수 있습니다. |
| 둘베코' s PBS + 나트륨-피루브산 + 포도 | 생명 기술 | 14287-072 | 이 D-PBS에 존재하는 칼슘과 마그네슘이 효소 소화를 촉진하기 때문에 이러한 유형의 D-PBS를 사용하는 것이 매우 중요합니다 |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE 헬스케어 | 17-5446-52 | 밀도 그라디언트 미디어. 양호한 간기를 얻으려면 단일 세포 현탁액의 층이 >45°C에서 발생하는 것이 중요합니다. 매우 낮은 속도에서 각도를 이루고 후속 원심 분리는 19°C에서 수행됩니다. |
| &알파; MEM | 시그마-알드리치 | M8042 | 웜 37 ° C 사용 전 수조 |
| 200 mM L-글루타민 | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x 항생제-항진균제 | Life Technologies | 15240-062 | 페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존 |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | 마그네틱 비드 |
| 비오틴화 다클론 토끼-안티-마우스 IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Dynabeads와 함께 사용하는 것이 권장되는 DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D 자석에 설명된 항-쥐 CD146 항체와 일치하는 바이오틴화된 2차 항체 |
| . 참고: 자석은 제조업체에 따라 선택해야 합니다.' S 선택 자석 구슬의 지침. | |||
| TrypLE 익스프레스 | Life Technologies | 12605-028 | 순한 비 트립신 대체품, 1ml의 TrypLE express/25cm2 표면적을 사용하십시오. 분리 후 10ml L-MSC 배양 배지는 3ml TrypLE |
| 항쥐 CD146 항체 | . | C35841 | 12.5 & l per 0.5 x 106 세포 |
| 펜타스타판(펜타스타치 용액) | Bristol-Myers Squibb Canada | - | 지역 헌혈 서비스 또는 혈액학과를 통해 얻을 수 있습니다. 또는 0.9% NaCl로 1:1로 희석된 PSI 20% 펜타스타치 용액(Preservation Solutions, PST001)을 사용할 수 있습니다. |
| Mr. Frosty 냉동 용기 | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | -80°C에서 밤새 L-MSC를 동결할 때 생존력을 향상시킵니다. 씨 |
참고문헌
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Wei, H. J., et al. FOXF1 mediates mesenchymal stem cell fusion-induced reprogramming of lung cancer cells. Oncotarget. 5....
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재인쇄 및 허가
