בידוד של CD146⁺ תאי סטרומה mesenchymal ריאות התושב מריאות העכברוש

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקת בידוד לקבלת תאי סטרומה mesenchymal תושב ריאה הראשית של חולדות, באמצעות עיכול אנזימטי, הפרדת שיפוע צפיפות, דבקות פלסטיק CD146 ⁺ מבחר חרוז מגנטי.

Abstract

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. יתר על כן, יש להם סיכוי תפקיד בהתפתחות איבר רגיל, יוחסו תפקידי מחלה, במיוחד אלה עם אופי fibrotic. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה. טכניקת הבידוד המתוארת כאן חלה מאפיינים מרובים של MSCs תושב ריאות (L-MSCs). עם הקרב של החולדות, ריאות יוסרו ושטף מספר פעמים כדי להסיר דם. בעקבות ניתוק מכני על ידי אזמל, הריאות מתעכלים במשך 2-3 שעות תוך שימוש בתמהיל שאני סוג collagenase, פרוטאז נייטרלי ואני סוג DNase obtaineהשעית תא בודד ד נשטפה לאחר מכן ו שכבתית מעל בינוני שיפוע צפיפות (צפיפות 1.073 גרם / מיליליטר). לאחר צנטריפוגה, תאים מן שלבי נשטפים מצופים צלוחיות תרבות שטופלה. הם תאים בתרבית עבור 4-7 ימים פיזיולוגיים 5% O _2, 5% CO ₂ תנאים. כדי לרוקן פיברובלסטים (CD146 ^-) ולהבטיח אוכלוסייה של L-MSCs בלבד (CD146 ^+), סלקציה חיובית עבור תאי CD146 ⁺ מתבצע באמצעות מבחר חרוז מגנטי. לסיכום, הליך זה באופן מהימן מייצרת אוכלוסייה-MSCs L העיקרי למחקר נוסף במבחנה ומניפולציה. בגלל האופי של הפרוטוקול, זה יכול להיות מתורגם בקלות במודלים של בעלי חיים ניסיוניים אחרים.

Introduction

תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) מוכרים יותר ויותר עבור הפוטנציאל הטיפולי שלהם במגוון רחב של מחלות, כולל מחלות ריאה. מלבד השימוש מח עצם MSCs טבורי עבור טיפול בתאי אקסוגניים, יש גם עניין גובר של תיקון פוטנציאל ההתחדשות של MSCs רקמות תושב. במהלך הפיתוח, לרבות הריאות, mesenchyme מהווה מקור חשוב של רמזים התפתחותית, ו MSCs תושב מועמד סביר להיות במרכז זה. יתר על כן, ראיות המתעוררים MSCs התושב מוטרדים במחלות מבוגרות, כולל ^1,2 הסרטן ^ו -3 סיסטיק. המשוכה העיקרית לחקר MSCs רקמות תושב האלה היא חוסר סמן ברור עבור בידוד וזיהוי של תאים אלה ^4. תא גזע אנטיגן-1 (SCA-1) זוהה בעכברים כסמן עבור מגוון רחב של תאי גזע רקמות, והוא יכול לשמש עבור בידוד של L-MSCs ^5, אבל יש לצערילא ידוע orthologs במינים אחרים ^6. חוקר דיווחתי במגוון שיטות בידוד שונה עבור בידוד של L-MSCs משתי רקמת ריאה או נוזל. אלה משתנה מתא מופעל קרינת מיון (FACS) שיטות המבוסס בחירה עבור CD31 ^– / CD45 ^– / CD90 ^{+ תאי 7,} CD31 ^– / CD45 ^– / מולקולת הידבקות תא אפיתל (EpCAM) – / SCA-1 + תאי ^8, התנגדות multidrug טרנספורטר ATP מחייבת קלטת G (ABCG2) תאים חיוביים ⁹ או בזרימה לצבוע Hoechst 33342 ^10, כדי דבקות פלסטיק ^11,12 והגירה מתוך רקמות טחונות ^13.

היתרונות של שיטה המוצגת במסמך זה הוא פי כמה וכמה. באמצעות עיכול אנזימטי עדין שיפוע צפיפות ^14, אחד מקבל את כל התאים של טווח צפיפות הכוללים MSCs אך אינם כוללים תאי אפיתל או האנדותל. הצעד הדבק הפלסטיק הבא מבטיח רק כי mesenchתאי ymal לדבוק ולהישאר בתרבות, ביטול לויקוציטים. והכי חשוב עם זאת, בשלב של בחירת CD146 ⁺ מאפשר החיסול פיברובלסטים, כמו תאים אלה אינם מבטאים CD146. ביטוי של מולקולת הידבקות תא CD146 מתואם חיובי עם multipotency, ולכן הוא סמן טוב על מנת לשרש פיברובלסטים מאוכלוסיית תא mesenchymal ^15-19. זהו יתרון על פני שימוש CD90 כסמן בחירה, כפי שהוא לא מתבטא רק MSCs אלא גם lipofibroblasts ^5,20. בפרוטוקול זה בחרנו במפורש מבחר חרוז מגנטי, כפי שהוא עדין על התאים, ואת ההליך כולו יכול להיעשות בתנאים סטריליים. יתרון חשוב נוסף של שיטת הבידוד הזה בניגוד לשיטת התולדה, הוא שזה מהיר יחסית, 6-10 ימיםלעומת חודש או יותר לשיטת התוצאה. שלושה עד חמישה ימים לאחר הבידוד הראשוני אוכלוסיית mesenchymal מוכנה CD146 ⁺ Sele גודל ction; לאחר שלושה עד חמישה ימים אחר התאים ⁺ CD146 מוכנים לשמש בניסויים או אפשר להקפיא לשימוש מאוחר יותר. שעת תרבות הירד משפרת את איכות התאים כמו MSCs transdifferentiate כלפי פיברובלסטים בתרבות לשעבר ממושך vivo ^19. לבסוף, בשל אופיו של פרוטוקול, אפשר ליישם את השיטה כדי מינים אחרים על ידי בחירת נוגדנים מתאימים, או אפילו מערכות איברים אחרות על ידי התאמת הבחירה של אנזימים לעיכול זמן דגירה.

פרוטוקול מפורט של שיטת הבידוד הזה הוא כדלקמן, וכן סקירה סכמטית של הבידוד והבחירה הבאה של תת-האוכלוסייה ⁺ CD146 מסופקת באיור 1A ו -1 B בהתאמה. בנוסף, פרטים כלולים עבור passaging, הקפאה להפשרה תאים אלה.

המודעה / 53,782 / 53782fig1.jpg "/>
באיור 1. סקירה סכמטי של בידוד של תאים mesenchymal ריאתי (א) ו CD146 עוקבות ⁺ בחירת תא (B) מינ '= דקות.; EDTA = חומצה Ethylenediaminetetraacetic; 2 ^nd Ab = נוגדנים משני; אלפא-CD146 Ab = העיקרי נוגדן אנטי CD146; תאי -ve = CD146 תאים שליליים; + יש תאים = תאים חיוביים CD146. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת אוטווה (פרוטוקול אתיקה חיה Ohri-1696). טיפול בחיות בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. בידוד של תאים סטרומה mesenchymal ריאות מכינים א?…

Representative Results

שניים מן המאפיינים הפיזיים הכי אמין של MSCs, צפיפות ודבקות פלסטיק, משמשים בחלק הראשון של פרוטוקול זה כדי לקבל את החלק היחסי תא mesenchymal של הריאה המכיל L-MSCs. למרות שלבי שיפוע הצפיפות יכללו מונוציטים ומקרופגים בנוסף לתאי mesenchymal ריאות, דבקות הפלסטיק ואחריו 3-…

Discussion

הבידוד והתרבות של L-MSCs העיקרי מהווה הזדמנות כדי להבין טוב יותר את תפקידם ואת האינטראקציה שלהם עם אוכלוסיות תאים אחרים ברמה התאית, ותפקידם בהתפתחות הריאות, בבריאות ובחולי. זה חשוב במיוחד כאשר חוסר סמן ספציפי אחד של תאים אלה עושה את זה כמעט בלתי אפשרי ריבויים באתרו.</em…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC