CD146の単離<sup> +</supラット肺から>常駐肺間葉系幹細胞

Summary

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 ⁺磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。

Abstract

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。また、彼らはおそらく正常な臓器発達における役割を持っている、と疾患における役割、線維性自然との特にそれらを起因しています。これらの居住者組織MSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。ここで説明する分離技術は、肺常駐のMSC（L-のMSC）の複数の特性が適用されます。ラットの屠殺時に、肺を除去し、血液を除去するために複数回洗浄します。メスによる機械的解離後、肺をコラゲナーゼタイプI、中性プロテアーゼおよびDNアーゼI型obtaineのミックスを使用して、2〜3時間のために消化され、D単一細胞懸濁液は、その後の密度勾配媒体（密度1.073グラム/ミリリットル）で洗浄し、積層されています。遠心分離した後、間期からの細胞を洗浄し、培養処理フラスコに播種しました。細胞は、生理的な5％O _{2、5％CO 2}条件下で4〜7日間培養します。線維芽細胞（CD146 ^{– ）}を枯渇させると、CD146 ⁺細胞についてのみ、L-MSCの（CD146 ^+）、正の選択の人口を確保するために磁気ビーズ選択を介して行われます。要約すると、この手順は確実に、さらにin vitro試験および操作のための主要なL-MSCの集団を生成します。なぜなら、プロトコルの性質上、それは容易に他の実験動物モデルに変換することができます。

Introduction

間葉系間質細胞（MSC）は、ますます肺疾患を含む、疾患の広い範囲でそれらの治療の可能性のために認識されています。外因性の細胞治療のための骨髄や臍帯MSCの使用のほかに、居住者組織のMSCの修復と再生の可能性が注目もあります。開発中は、肺を含め、間充織は、発達の手がかりの重要な源であり、レジデントMSCは、このの中心である可能性が高い候補です。また、証拠は、常駐のMSCは、癌^1,2および線維症^3を含む 、成人病に乱されていることが浮上しています。これらの居住者組織のMSCの研究のための主要なハードルは、これらの細胞⁴の単離および同定するための明確なマーカーの欠如です。幹細胞抗原-1（SCA-1）組織幹細胞の種々のマーカーとして、マウスにおいて同定された、およびL-MSCの⁵の単離に用いることができるが、残念ながらあり他の種⁶にオルソログを知られていません。研究者らは、肺組織または体液のいずれかからL-MSCの単離のための別の単離方法の様々な報告しています。 / CD45 ^{– / –} CD90 ⁺細胞^{7、CD31 –} / CD45 ^– /上皮細胞接着分子（EpCAM） – / SCA-1 +細胞^8、多剤耐性トランスポーターこれらは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）CD31について選択に基づいた方法によって異なります細分化した組織¹³のうちプラスチック接着^11,12および移行へのATP結合カセットG（ABCG2）陽性細胞⁹またはヘキスト33342色素流出^10、。

本明細書に提示された方法の利点は数倍です。穏やかな酵素消化および密度勾配^{14を使用することによって} 、人はMSCを含むが、上皮または内皮細胞を排除密度範囲のすべてのセルを取得します。その後のプラスチック接着ステップはmesenchことを保証しますymal細胞が付着し、白血球を除去すること、文化にとどまります。これらの細胞はCD146を発現しないように最も重要なのが、CD146 ^{+選択ステップ}は、線維芽細胞の排除を可能にします。細胞接着分子CD146の発現を正に多分化と相関し、したがって、間葉細胞集団^15-19からの線維芽細胞を取り除くための良好なマーカーです。それは唯一のMSCにもlipofibroblasts ^5,20では発現されないので、これは、選択マーカーとしてCD90を使用よりも有利で ​​す。それが細胞に緩やかにあるように、このプロトコルでは、我々は明示的、磁気ビーズ選択を選択している、と全体の手順は無菌状態で行うことができます。成長方法とは対照的に、この分離方法の別の重要な利点は、それが成長法の月以上とは対照的に、6-10日比較的高速であることです。 3〜5日最初の単離後に、間葉系人口は、CD146 ⁺ SELEの準備ができています ction。別の3〜5日後、CD146 ⁺細胞を、実験のために使用される準備ができているか、後の使用のために凍結することができます。 MSCは、長期のex vivo培養 ¹⁹内の線維芽細胞に向かって分化転換として文化の減少時間は、細胞の品質が向上します。最後に、ためのプロトコルの性質のため、消化酵素とインキュベーション時間の選択を調整するだけで適切な抗体を選択することによって、あるいは他の器官系に他の種に​​この方法を適用することができます。

この分離方法の詳細なプロトコルは、以下に与えられ、CD146 ^+亜集団の単離およびその後の選択の概略図を、それぞれ図1Aおよび 1Bに設けられています。さらに、詳細はこれらの細胞を凍結し、解凍、継代のために含まれています。

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図1肺間葉細胞（A）の単離およびその後のCD146 ^+細胞選択（B）の概略分=分。 EDTA =エチレンジアミン四酢酸; 2 ^番目のAb =二次抗体; α-CD146抗体=一次抗CD146抗体; -ve細胞= CD146陰性細胞; +は= CD146陽性細胞ve細胞。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Protocol

すべての手順は、オタワ大学の動物実験委員会（動物の倫理プロトコルOHRI-1696）によって承認されました。動物のケアは、機関のガイドラインに従って行いました。 肺間葉系幹細胞の単離1。 50ミリリットルチューブに酵素ミックスを調製する：これらの金額は、成体マウスやラットの仔の肺に十分2500 UコラゲナーゼIおよび500 UのDNAse Iを、30 U中性プロテアーゼで…

Representative Results

MSCは、密度およびプラスチック付着の最も信頼性の高い物理的特性の二つは、L-MSCを含んでいる肺の間葉系細胞画分を得るために、この手順の最初の部分で使用されています。密度勾配相間は、肺間葉系細胞に加えて、単球およびマクロファージが含まれますが、文化の3〜5日に続いてプラスチック接着は肺間葉系細胞が残っていることを保証します。実際、この細?…

Discussion

プライマリL-MSCの単離と文化はより自分の機能や細胞レベルで他の細胞集団との相互作用、および肺の開発、健康と病気におけるその役割を理解するための機会を提供します。これらの細胞の特異的な単一のマーカーの欠如は、in situで 、これらの細胞を研究することはほぼ不可能、これは特に重要です。すべてのプライマリ細胞集団と同様に、1は、これらの細胞が長い彼らは^（24<…

Materials

Neutral Protease	Worthington Biochemical Corporation	LS02104	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Collagenase I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	Prepare on day of isolation and store at 4°C until use
Pentobarbital sodium (Euthanyl)	Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland	–	Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more.
Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose	Life Technologies	14287-072	Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion
Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)	GE Healthcare	17-5446-52	Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	Warm in 37oC water bath before use
200 mM L-Glutamine	Life Technologies	25030-164
100x Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062	Penicillin/Streptomycin/Fungizone
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	Magnetic beads
biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG	Dako, Agilent Technologies	E0464	Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below
DynaMag5-magnet	Life Technologies	12303D	Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice.
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE
anti-rat CD146 antibody	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μl per 0.5 x 106 cells
Pentaspan (pentastarch solution)	Bristol-Myers Squibb Canada	–	Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl.
Mr.Frosty freezing container	ThermoFisher Scientific	5100-0001	Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC