Aislamiento de CD146<sup> +</sup> Las células estromales mesenquimales de pulmón Residente de los pulmones de ratas
Summary
Este protocolo describe una técnica de aislamiento para obtener células mesenquimales del estroma residentes de pulmón primarios de ratas, mediante el uso de la digestión enzimática, la separación por gradiente de densidad, la adherencia de plástico y CD146 + selección de perlas magnéticas.
Abstract
las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Por otra parte, que probablemente tienen un papel en el desarrollo normal de órganos, y se han atribuido funciones en la enfermedad, en particular aquellos con una naturaleza fibrótica. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células. La técnica de aislamiento descrito aquí se aplica múltiples características de las MSC residentes de pulmón (L-MSC). Después del sacrificio de las ratas, los pulmones se retiran y se enjuagan varias veces para eliminar la sangre. Tras la disociación mecánica por bisturí, los pulmones se digieren durante 2-3 hr usando una mezcla de colagenasa tipo I, proteasa neutra y el tipo de DNasa I. El obtainesuspensión de células individuales d se lava posteriormente y en capas sobre medio de gradiente de densidad (densidad 1,073 g / ml). Después de la centrifugación, las células de la interfase se lavaron y se sembraron en frascos de cultivo tratadas. Las células se cultivan durante 4-7 días en fisiológica 5% de O2, 5% de CO 2 condiciones. Para agotar los fibroblastos (CD146 -) y para asegurar una población de sólo la selección L-MSC (CD146 +), positivo para las células CD146 + se lleva a cabo a través de la selección de perlas magnéticas. En resumen, este procedimiento fiable produce una población de primaria L-MSC para su posterior estudio y manipulación in vitro. Debido a la naturaleza del protocolo, que puede ser fácilmente traducido a otros modelos animales experimentales.
Introduction
las células estromales mesenquimales (MSC) son cada vez más reconocidos por su potencial terapéutico en una amplia gama de enfermedades, incluyendo enfermedades pulmonares. Además del uso de la médula ósea y las MSC del cordón umbilical para la terapia celular exógena, hay también un creciente interés en la reparación y el potencial regenerativo de las MSC de tejido residentes. Durante el desarrollo, incluyendo en el pulmón, el mesénquima es una importante fuente de señales de desarrollo, y las MSC residentes son un probable candidato para estar en el centro de esta. Por otra parte, la evidencia está emergiendo que las MSC residentes son perturbados en enfermedades de adultos, incluyendo el cáncer y la fibrosis 1,2 3. El obstáculo principal para el estudio de estos MSC de tejido residentes es la falta de un marcador claro para el aislamiento e identificación de estas células 4. Célula de vástago antígeno-1 (Sca-1) fue identificado en ratones como un marcador para una variedad de células madre de tejido, y se puede utilizar para el aislamiento de L-MSC 5, pero tiene por desgraciasin ortólogos conocido en otras especies 6. Los investigadores han informado una variedad de diferentes métodos de aislamiento para el aislamiento de L-MSC ya sea de tejido pulmonar o líquido. Estos varían de células activadas por fluorescencia métodos (FACS) basados selección para CD31 – / CD45 – / CD90 + células 7, CD31 – / CD45 – / epitelial molécula de adhesión celular (EpCAM) – / Sca-1 + 8, resistencia a múltiples fármacos transportador ATP casete de unión a G (ABCG2) células positivas 9 o Hoechst 33342 flujo de salida de colorante 10, a la adherencia de plástico 11,12 y la migración de tejido picado 13.
Las ventajas del método presentado en este documento son varias veces. Mediante el uso de una digestión enzimática suave y gradiente de densidad 14, se obtiene todas las células de la gama de densidad que incluyen MSCs pero excluyen las células epiteliales o endoteliales. El paso de la adherencia de plástico posterior asegura que sólo el mesenchymal células se adhieran y se quedan en la cultura, la eliminación de los leucocitos. Sin embargo es más importante, la etapa de selección CD146 + permite la eliminación de los fibroblastos, ya que estas células no expresan CD146. La expresión de la molécula de adhesión celular CD146 se correlaciona positivamente con la multipotencia, y por lo tanto es un buen marcador para eliminar a los fibroblastos a partir de una población de células mesenquimales 15-19. Esto es una ventaja sobre el uso de CD90 como marcador de selección, ya que no sólo se expresa en las MSC, sino también en lipofibroblasts 5,20. En este protocolo se ha elegido de forma explícita una selección de perlas magnéticas, ya que es más suave en las células, y todo el procedimiento se puede realizar en condiciones estériles. Otra ventaja importante de este método de aislamiento en comparación con el método de derivación, es que es relativamente rápido, 6-10 días en contraposición a un mes o más para el método de extensión. De tres a cinco días después del aislamiento inicial y la población mesenquimales está listo para CD146 + sele cción; después de otros tres a cinco días las células CD146 + están listos para ser utilizados en los experimentos o se pueden congelar para su uso posterior. El tiempo de disminución de la cultura mejora la calidad de las células como MSCs transdifferentiate hacia fibroblastos en cultivo prolongado ex vivo 19. Por último, debido a la naturaleza del protocolo, es posible aplicar este método para otras especies simplemente eligiendo anticuerpos apropiados, o incluso a otros sistemas de órganos mediante el ajuste de la elección de las enzimas de fermentación y el tiempo de incubación.
Un protocolo detallado de este método de aislamiento se da a continuación, y una vista general esquemática del aislamiento y la posterior selección de la subpoblación CD146 + se proporciona en la Figura 1A y 1B, respectivamente. Además, se incluyen detalles de los pases, la congelación y descongelación estas células.
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Figura 1. Esquema general del aislamiento de las células pulmonares mesenquimales (A) y la posterior CD146 + selección de célula (B) min = minutos.; EDTA = ácido etilendiaminotetraacético; 2º Ab = anticuerpo secundario; a-CD146 Ab = anticuerpo anti-CD146 primaria; células negativas -ve células CD146 =; + ve células células CD146 positivas =. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento y cultivo de primaria L-MSC presenta una oportunidad para comprender mejor su función y su interacción con otras poblaciones celulares a nivel celular, y su papel en el desarrollo del pulmón, la salud y la enfermedad. Esto es especialmente importante ya que la falta de un marcador individual específico de estas células hace que sea casi imposible el estudio de estas células in situ. Al igual que con todas las poblaciones de células primarias, se debe tener en cuenta que estas células son …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JJPC is supported by a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) postdoctoral fellowship. MAM receives a merit scholarship from the German National Academic Foundation – Studienstiftung des Deutschen Volkes and is supported by a grant from the EFCNI (European Foundation for the Care of the Newborn Infant). BT is supported by CIHR, the Canadian Lung Association, the Stem Cell Network and the Children’s Hospital of Eastern Ontario Research Institute.
Materials
| Neutral Protease | Worthington Biochemical Corporation | LS02104 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Collagenase I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D5025 | Prepare on day of isolation and store at 4°C until use |
| Pentobarbital sodium (Euthanyl) | Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin, Ireland | – | Use 0.2 mL for rat pups between 20-30g; larger animals may need more. |
| Dulbecco’s PBS + Sodium-pyruvate + Glucose | Life Technologies | 14287-072 | Very crucial to use this type of D-PBS, as the calcium and magnesium that are present in this D-PBS facilitate facilitate the enzymatic digestion |
| Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3) | GE Healthcare | 17-5446-52 | Density gradient media. To obtain a good interphase, it is crucial that the layering of the single cell suspension occurs at a >45o angle at very low speed, and that the subsequent centrifugation is done at 19oC. |
| αMEM | Sigma-Aldrich | M8042 | Warm in 37oC water bath before use |
| 200 mM L-Glutamine | Life Technologies | 25030-164 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | Penicillin/Streptomycin/Fungizone |
| M-280 Dynabeads | Life Technologies | 11205D | Magnetic beads |
| biotinylated polyclonal rabbit-anti-mouse IgG | Dako, Agilent Technologies | E0464 | Biotinylated secondary antibody that matches with the anti-rat CD146 antibody described below |
| DynaMag5-magnet | Life Technologies | 12303D | Magnet that is recommended for use with Dynabeads. NOTE: magnet should be chosen based on the manufacturer’s instructions of the magnet beads of choice. |
| TrypLE express | Life Technologies | 12605-028 | Gentle non-trypsin alternative, use 1 mL of TrypLE express/ 25cm2 surface area. After detachment, 10 mL L-MSC culture medium is sufficient to inactivate 3 mL TrypLE |
| anti-rat CD146 antibody | Lifespan Biosciences Inc. | C35841 | 12.5 μl per 0.5 x 106 cells |
| Pentaspan (pentastarch solution) | Bristol-Myers Squibb Canada | – | Can be obtained through local blood donation services or hematology departments. Alternatively, one could use the PSI 20% Pentastarch solution (Preservation Solutions, PST001) diluted 1:1 with 0.9% NaCl. |
| Mr.Frosty freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | Improves viability when freezing L-MSCs overnight at -80oC |
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