成像使用烟草瞬时表达系统MAPK信号通路的空间重组
Summary
At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.
Abstract
在活细胞中的动态信号事件的可视化一直是个挑战。我们扩大建立瞬时表达系统，在烟草表皮细胞的生物分子荧光互补（附设）测定中，从检测蛋白质 – 蛋白质相互作用，以监测在植物细胞中的信号转导的空间分布。在这个协议中，我们所用的附设测定以表明相互作用和拟南芥 MAPKKK YODA和MAPK6之间的信令发生在质膜。当支架蛋白BASL被共表达时，YODA-MAPK相互作用引入并与CFP-BASL空间共极化。此改性烟草表达系统允许信令本地化和动态变化（小于4天），可容纳的荧光蛋白的颜色（至少三个）多个快速检查。我们还提出了具体的方法来定量蛋白质分布（非对称的空间定位，或“两极分化”;）在烟草细胞。这种先进的烟草表达系统具有用于在活的植物细胞动态信令事件的快速测试被广泛使用的潜力。
Introduction
蛋白质错综复杂的分层网络，并形成络合物的发挥，在一个不可预知的细胞环境发生的几乎所有的生物过程的关键角色中进行互动。然而，从植物发育生长的响应，所以一直缺乏方便的工具，不仅可以快速而且有效地在亚细胞水平识别和监控这些动态信号事件。
烟草叶表皮瞬时表达系统已经呼吁优势，为在活细胞中可视化的荧光蛋白质。这个系统提供了半体内条件允许翻译后蛋白质修饰和蛋白质定位快速检查。通过检查补充YFP信号时，双分子荧光互补（附设）测定通知蛋白质 – 蛋白质相互作用的在植物细胞中的可能性。相比其他方法， 如酵母双杂交（Y2H）和Co-immunoprecipitation（联合IP）附设还提供了可视化，其中在亚细胞水平，可能会发生蛋白 – 蛋白相互作用室的有力手段。
因为不对称细胞分裂（ACD）保存干细胞群的同时用于组织/器官形成产生新的细胞类型，它对于促进真核多细胞不可或缺的机制。 拟南芥气孔发展已被用作模型系统，用于在植物中学习的ACD。的前体细胞，拟分生组织母细胞，除以不对称产生两种不同的子细胞中，拟分生组织（经历终止于一对保卫细胞之前干细胞样师）和一个气孔谱系接地单元（SLGC）（可分裂并分化成路面细胞），分别为（ 图1）。在气孔ACD，在天堂气孔不对称的新型蛋白质断裂（BASL）被premitotically极化带动分裂不对称，这INC路得身体不对称和细胞命运的不对称1。该MAPKKK YODA和的MAPKs，MPK3和6组成的MAPK级联是中部的气孔师图案和命运采用2,3，4,5。
近日，张某等人 。联极性蛋白BASL在拟南芥的气孔ACD 6 YDA-MAPK信号通路。规范YODA-MAPK通路，通MPK3 / 6，磷酸BASL并激活它的两极分化。磷酸BASL用作脚手架和募集YODA（YDA）和MPK3 / 6，以形成蛋白复合物，并在细胞皮质6集中的信令。 MAPK信号分量和BASL和YDA-MAPK途径之间的正反馈环的极化表示用于在植物细胞中的蛋白质偏振一种新的机制。当地丰富的MAPK信号是假设紧扣细胞命运分化气孔ACD 6（ 图1）。一项所述的k的一个支持这种模式安永实验数据从表现在BASL 6的诱导表达的的MAPKs的空间再分配烟草检测出来。
在一般情况下，这是不容易来监控发生MAPK信号因为MAPK分子经常发现到处一个细胞的内部。在这项研究中，我们所用的拆分YFP系统可视化的上游激酶和下游的人之间的相互作用暗示其中信令中继发生。我们通过进一步延长使用附设系统的共表达的第三蛋白（CFP-标签）与分割YFP对（暗示蛋白质 – 蛋白质相互作用的）来可视化是否以及如何补充YFP可以由共进行空间调制CFP表达的蛋白质。通过这样做，我们证明在烟草表皮的细胞皮层诱导YDA和MPK 6，之间的相互作用空间重组从均匀分布到极化图案CFP-BASL的共表达人的细胞。因此，这种系统具有用于当细胞被内部或外部刺激挑战监控的条件下在植物细胞中动态信令事件待开发的潜力（ 例如，其它蛋白质，化学应用，病原体攻击，或者环境变化等的共表达。 ）。
Protocol
Representative Results
Discussion
一般使用和信号转导的烟草瞬时表达系统的可能的修改：荧光蛋白的过表达（FP）-tagged在烟草表皮蛋白已成功用于在植物细胞中蛋白的亚细胞定位的快速检测。然而，在植物中研究蛋白质复合物的动态信令分配是一项具有挑战性的主题，由于复杂的亚细胞环境中，瞬时蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导事件。为了应对这一挑战，我们采取了附设系统的优势，研究MAPK信号的事?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yumeng (Helen) Xia (Rutgers University) for manuscript editing. The work on BASL polarity formation is supported by grants from the U.S. National Institute of General Medical Sciences to J.D. (R01GM109080) and Rutgers University.
Materials
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| pENTR/D/TOPO | Life Technologies | K2400-20 | |
| QuickChange II XL Site-directed Mutagenesis Kit | Agilent Technology | 200521 | |
| LB broth | AMRESCO | J106-2KG | |
| Bacto Agar | AMRESCO | J673-1KG | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G3632-1G | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K4000-25G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014-5G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| 25x75mm Slide | VWR | 16004-382 | |
| 24×50 mm Cover glass | VWR | 48393-241 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | LAS AF Lite software |
| 40 x objective lens | Leica | HCX Plan APO | HCX Plan APO , NA 1.30 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | SORVALL 6+ | |
| Hole puncher | Staples | ||
| 50 ml falcon tubes | Genesee Scientific | 21-108 | |
| No. 5 Forceps | Canemco & Marivac | 205EQA-Spec |
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