분석<em> 생체</em> 셀 마이그레이션 Zebrafish의 배아에서 세포 이식 및 시간 경과 이미징을 사용하여
Summary
Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.
Abstract
Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.
Introduction
다세포 생물에서, 세포 이동은, 조직 및 기관에 대한 세포의 조직을 보장 배아의 발달과 그 조직의 항상성 (상처 치유) 및 내성에 참여한다 성인기에 대해 모두 필요하다. 이러한 생리 기능에 더하여, 세포 이동은 암 전이를 포함한 특정의 다양한 병리학 적 상황에 참여하고있다.
세포 이동은 평평한 표면에 세포의 움직임을 보장하는 분자 메커니즘의 전반적인 이해를 제공, 수십 년 동안 시험관에서 분석하고있다. 생체 내에서 그러나, 세포는 더 복잡한 환경에 직면하고 있습니다. 명확하게 마이그레이션을 안내 세포 분비 케모카인 이웃, 같은 세포 외 매트릭스 유기체 내에서 마이그레이션이 외부 단서에 의해 영향을받을 수 있다는 것을 지난 몇 년에 등장하고, 그 설명 된 내용과 다를 수 있습니다 세포 이동을 구동 메커니즘 <EM> 체외 1,2. 생체 내 세포의 이동에 보장 메커니즘은 체외 연구에 비해, 주로 인해 증가 된 기술적 인 어려움 때문에 훨씬 적은 관심을 받았다. 생체 특히 세포 이동의 분석 이주 세포에 직접 광 액세스를 필요로 독특한 셀 라벨을 기술 그 동역학 및 형태뿐만 아니라, 이득 또는 기능의 상실을보고하기 위해 후보 유전자의 역할을 테스트하기 위해 접근한다. 지금까지, 이러한 특성을 보유하는 몇 모델 시스템은 생체 내 세포 이동 (3)에 절개하는데 사용되어왔다.
최근 생체 세포의 이동의 제어에 4,5- 후보 유전자의 기능을 평가하기 편리한 새로운 모델 시스템으로 초기 제브라 피쉬 배아 예상 prechordal 플레이트의 이동을 사용 하였다. (또한 전방 mesendoderm라고도 함) 유망 prechordal 플레이트 가스트의 발병에 형성하는 셀 그룹배아의 등쪽면에 rulation. 낭배 동안이 그룹은 공동으로 척색에 prechordal 판, mesendodermal 비후, 전방을 형성하고, 신경 판을 기본에, 배아 6-8의 동물 극으로 이동한다. 그 후방 부분은 가능성이 중배엽 (9) 머리에 기여하면서 prechordal 판의 앞쪽 부분은 부화 선을 야기 할 것이다. 외부 개발 및 어류 배아의 광학 투명도 덕분에, 세포의 이동이 직접적으로 쉽게 구조에서 관찰 될 수있다.
세포 이식은 모자이크 배아 (10)의 신속하고 쉽게 만들 수 있습니다 매우 강력한 기술이다. 분리 된 세포의 라벨에 이식 된 세포 결과에 형광 세포 골격 마커를 표현, 형태 및 역학있는 쉽게 관찰 할 수있다. 손실 함수의 게인이 결합은 허용에게 전지 캔의 자율 기능의 분석 접근didate 유전자.
제시된 프로토콜은 우리가 생체 5 세포 이동 및 굴지 역학을 제어에 TORC2 구성 요소 Sin1의 기능을 평가하는 방법에 대해 설명합니다. 결과를 상기에 언급 된 바와 같이하지만, 이는 생체 내에서 세포의 이동을 제어하는 후보 유전자의 잠재적 의미를 분석하기 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 생체 내에서 라이브 영상으로 세포 이식을 사용하여 키메라 배아의 생성을 결합하여 세포 이동의 후보 유전자의 역할을 연구하는 쉬운 방법을 제공합니다.
모자이크 배아의 생성
셀의 역학을 공부하는 것은 세포질 확장을 분석하기 위해 형상의 시각화가 필요합니다. 따라서 좋은 시각적 대비를 제공하고, 환경 – 또는 다르게 표시 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank F. Bouallague and the IBENS animal facility for excellent zebrafish care. Research reported in this publication was supported by the Fondation ARC pour la recherche sur le cancer, grants N° SFI20111203770 and N° PJA 20131200143.
Materials
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | standard thickness |
| Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm) | Harvard Apparatus | 300085 | thin-walled |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml |
| fine tweezers | Dumont Fine Science Tools | 11254-20 | 5F |
| glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | |
| Air transjector | Eppendorf | 5246 | |
| Micro-forge | Narishige | MF-900 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 | |
| Micromanipulator (for injection) | Narishige | MN-151 | |
| Micromanipulator (for cell transplantation) | Leica | Leica Micromanipulator | |
| Hammilton Syringe | Narishige | IM-9B | |
| Micropipette puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Transplantation mold | Adapative Science Tools | PT-1 | |
| Needle holder | Narishige | HI-7 | |
| Tube connector | Narishige | CI-1 | |
| PTFE tubing | Narishige | CT-1 |
References
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 813-824 (2014).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature reviews. Molecular cell biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Dang, I., Gorelik, R., et al. Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration. Nature. , (2013).
- Dumortier, J. G., David, N. B. The TORC2 Component, Sin1, Controls Migration of Anterior Mesendoderm during Zebrafish Gastrulation. Plos One. 10, e0118474 (2015).
- Solnica-Krezel, L., Stemple, D. L., Driever, W. Transparent things: cell fates and cell movements during early embryogenesis of zebrafish. BioEssays. 17 (11), 931-939 (1995).
- Ulrich, F., Concha, M. L., et al. Slb/Wnt11 controls hypoblast cell migration and morphogenesis at the onset of zebrafish gastrulation. Development. 130 (22), 5375-5384 (2003).
- Dumortier, J. G., Martin, S., Meyer, D., Rosa, F. M., David, N. B. Collective mesendoderm migration relies on an intrinsic directionality signal transmitted through cell contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 1-6 (2012).
- Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of visualized experiments : JoVE. (29), (2009).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. The Journal of Cell Biology. 209 (1), 163-180 (2015).
- Gorelik, R., Gautreau, A. Quantitative and unbiased analysis of directional persistence in cell migration. Nature Protocols. 9 (8), 1931-1943 (2014).
- Sacan, A., Ferhatosmanoglu, H., Coskun, H. CellTrack: An open-source software for cell tracking and motility analysis. Bioinformatics. 24 (14), 1647-1649 (2008).
- Tahinci, E., Symes, K. Distinct functions of Rho and Rac are required for convergent extension during Xenopus gastrulation. Developmental biology. 259 (2), 318-335 (2003).
- Zhang, T., Yin, C., et al. Stat3-Efemp2a modulates the fibrillar matrix for cohesive movement of prechordal plate progenitors. Development. 141 (22), 4332-4342 (2014).
- Riedl, J., Crevenna, A. H., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Burkel, B. M., Von Dassow, G., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motility and the Cytoskeleton. 64 (11), 822-832 (2007).
- Yoo, S. K., Deng, Q., Cavnar, P. J., Wu, Y. I., Hahn, K. M., Huttenlocher, A. Differential regulation of protrusion and polarity by PI3K during neutrophil motility in live zebrafish. Developmental cell. 18 (2), 226-236 (2010).
- Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental biology. 393 (2), 209-226 (2014).
- Johnson, H. W., Schell, M. J. Neuronal IP3 3-kinase is an F-actin-bundling protein: role in dendritic targeting and regulation of spine morphology. Molecular biology of the Cell. 20 (24), 5166-5180 (2009).
- Yi, J., Wu, X. S., Crites, T., Hammer, J. A. Actin retrograde flow and actomyosin II arc contraction drive receptor cluster dynamics at the immunological synapse in Jurkat T cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (5), 834-852 (2012).
