Summary

Technique à la cible microinjection du Developing<em> Xenopus</em> Kidney

Published: May 03, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

Le rein embryonnaire de Xenopus laevis (grenouille), pronéphros, se compose d'un seul néphron, et peut être utilisé comme modèle pour les maladies rénales. Embryons de Xenopus sont grandes, à développer l' extérieur et peuvent facilement être manipulés par micro – injection ou des interventions chirurgicales. En outre, les cartes du destin ont été établis pour les premiers embryons de xénope. microinjection ciblée dans le blastomère individu qui finira par donner naissance à un organe ou d'un tissu d'intérêt peut être utilisé pour surexprimer sélectivement ou renverser l'expression des gènes dans cette région restreinte, ce qui diminue les effets secondaires dans le reste de l'embryon en développement. Dans ce protocole, nous décrivons comment utiliser des cartes de destin Xenopus établies pour cibler le rein en développement Xenopus (les pronéphros), par microinjection dans blastomère spécifique d'embryons 4 et 8 cellules. L'injection de traceurs de lignée permet de vérifier le ciblage spécifique de l'injection.Après les embryons se sont développés à l'étape 38 – 40, toute monture immunocoloration est utilisé pour visualiser le développement pronephrique, et la contribution des cellules ciblées aux pronéphros peut être évaluée. La même technique peut être adaptée pour cibler d'autres types de tissus, en plus des pronéphros.

Introduction

Le rein embryonnaire de Xenopus, les pronéphros, est un bon modèle pour étudier le développement du rein et de la maladie. Les embryons se développent à l'extérieur, sont de grande taille, peuvent être produites en grand nombre, et sont facilement manipulés par microinjection ou des interventions chirurgicales. En outre, les gènes qui régissent le développement du rein chez les mammifères et les amphibiens sont conservés. Reins de mammifères progresser à travers trois étapes: les pronéphros, mésonéphros et métanéphros 1, tandis que les amphibiens embryonnaires ont un pronéphros et amphibiens adultes ont un métanéphros. L'unité de filtrage de base de ces formes de rein est le néphron, et les mammifères et les amphibiens nécessitent les mêmes cascades de signalisation et des événements inductifs à subir néphrogenèse 2, 3. Le pronéphros Xenopus contient un seul néphron composé de proximal, intermédiaire, distale et reliant tubules, et un glomus (analogue au niveau du glomérule chez les mammifères) , 1, 4-6 (figure 1 </strong>). Le seul grand néphrons présent dans les pronéphros Xenopus le rend approprié comme un modèle simple pour l'étude des gènes impliqués dans les processus de développement du rein et de la maladie.

Cartes Cell sort ont été établis pour les premiers embryons de xénope et sont librement disponibles en ligne à Xenbase 7-11. Ici, nous décrivons une technique de micro – injection de traceurs de la lignée de cibler pronéphros Xenopus développement, bien que la même technique peut être adaptée pour cibler d' autres tissus tels que le cœur ou les yeux. traceurs sont des marqueurs de la lignée (y compris les colorants vitaux, les dextranes marqués par fluorescence, des enzymes détectables par voie histochimique et l'ARNm codant pour des protéines fluorescentes, etc.) qui peuvent être injectés dans un blastomère précoce, permettant la visualisation de la descendance de cette cellule au cours du développement. Ce protocole utilise MEM-RFP ARNm, membrane de codage cible rouge protéine fluorescente 12, comme traceur de la lignée. La technologie de micro-injection cibléeniques pour blastomères individuels dans des embryons de 4 et 8 cellules décrites ici peuvent être utilisées pour l'injection avec morpholinos pour abattre l'expression des gènes, ou avec de l'ARN exogène pour surexprimer un gène d'intérêt. En injectant dans la ventrale, blastomère végétale, principalement les pronéphros de l'embryon seront ciblés, laissant les pronéphros controlatéral comme un contrôle de développement. Co-injection d'un traceur vérifie que le bon blastomère a été injecté, et montre quels tissus dans l'embryon est née de la blastomère injecté, en vérifiant le ciblage des pronéphros. Immunocoloration des pronéphros permet la visualisation de la façon dont les tubules pronephrique ont été ciblés. Surexpression et knockdown effets peuvent ensuite être marqué contre le côté opposé de l'embryon, qui sert de contrôle du développement, et peuvent être utilisés pour calculer l'indice pronephrique 13. La disponibilité des cartes du destin cellulaire permet cette technique de micro-injection ciblée pour être utilisée pour cibler les tissus OTHer que les pronéphros, et co-injection d'un traceur fluorescent permet de microinjection ciblée pour chaque tissu à vérifier avant l'analyse.

Pendant embryon microinjection, la température de développement doit être réglementé étroitement, étant donné que le taux de développement de Xenopus est très dépendante sur elle 14. Les embryons doivent être incubés à des températures plus fraîches (14 – 16 ° C) pour les injections 4 et 8 cellules parce que le temps de développement est ralenti. A 22 ° C, le temps de développement de l'étape 1 (1 cellule) à l'étape 3 (4 cellules) est d'environ 2 heures, tandis que à 16 ° C le temps de développement à l'étape 3 est d'environ 4 heures. Il faut environ 15 minutes pour aller d'un embryon 4 cellules à une 8 cellules (stade 4) embryon à 22 ° C, mais il faut environ 30 minutes à 16 ° C. De même, à 22 ° C, il ne prend que 30 minutes pour un embryon de 8 cellules de progresser à un embryon de 16 cellules (étape 5). Ce temps est augmenté à 45 minutes à 16 ° C. lerefore, il est utile de ralentir le rythme des embryons de développement pour permettre assez de temps pour les injections au stade 8 cellules avant que les embryons progressent au stade 16 cellules. En outre, des températures de croissance peuvent être modulées pour accélérer ou ralentir le développement embryonnaire jusqu'à ce que le rein a pleinement développé.

L'épiderme des embryons de xénope têtard stade est relativement transparent, permettant une imagerie facile des pronéphros en développement sans dissection ou de compensation du tissu 15. En raison de la relative transparence des embryons de xénope, imagerie des cellules vivantes est également possible 16,17. Whole monture immunocoloration pour visualiser les pronéphros est possible avec des anticorps établis qui étiquettent proximale, intermédiaire, distale et tubules de connexion de l' étape 38 – 40 embryons qui permettent d'évaluer le développement pronephrique après manipulation de l' expression du gène ciblé dans les embryons de xénope 18-20.

Protocol

Le protocole suivant a été approuvé par l'Université du Texas Health Science Center au centre de Houston pour des animaux de laboratoire Comité de médecine bien-être animal, qui sert de soins en établissement et l'utilisation Comité (protocole #: HSC-AWC-13-135). 1. Identification et sélection des blastomères pour Injections de rein ciblées Avant de générer des embryons, utiliser le tableau normal du Xenopus développement 21 pour comprendre l'orientation …

Representative Results

Microinjections de 4 et 8 cellules d' embryons de xénope avec MEM-RFP ARNm montrent différents niveaux de ciblage pour les pronéphros. La figure 4 montre la scène 40 embryons avec des motifs appropriés d'expression de l' ARNm MEM-DP. Les embryons ont été injectés dans le blastomère ventral gauche (figure 4A), et triés pour le motif d'expression correcte du MEM-DP ARNm. En plus d'exprimer MEM-RFP dans le proximal, in…

Discussion

Cibler les pronéphros de développer des embryons de xénope repose sur l' identification et l' injection de la bonne blastomère. L' injection de la blastomère V2 des embryons à 8 cellules cible les pronéphros gauche 18. Cela laisse les pronéphros controlatérale droite comme un contrôle interne. Si morpholino knockdown ou d'ARN surexpression est utilisé pour modifier le développement du rein, les pronéphros controlatérale droite peuvent être utilisés pour comparer les ef…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par un National Institutes of Health subvention NIDDK (K01DK092320) et le financement de démarrage du département de pédiatrie à l'Université du Texas Medical School McGovern.

Materials

Sodium chloride Fisher S271-3
Potassium chloride Fisher P217-500
Magnesium sulfate  Fisher M63-500
Calcium chloride Fisher C79-500
HEPES Fisher BP310-500
EDTA Fisher S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL Amresco E737-20ML
L-Cysteine, 99%+ Acros Organics 52-90-4
Ficoll Fisher BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875712
Mini Fridge II Boekel 260009 Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. Invitrogen D1817 Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water Corning 46-000-CI
7" Drummond replacement tubes Drummond 3-000-203-G/XL Microinjection needles.
Needle puller Sutter Instruments P-30
Fine forceps Dumont 11252-30 For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II Drummond 3-000-204 Microinjector.
Mineral oil, heavy Fisher CAS 8042-47-5 Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle Covidien 8881200508 For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe BD 309646 For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
800 micron polyester mesh Small Parts CMY-0800-C
Transfer pipets Fisher 13-711-7M For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate Nest Biotechnology
MOPS Fisher BP308-500
EGTA Acros Organics 67-42-5
Formaldehyde Fisher BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial Fisher 03-339-25B For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate Nest Biotechnology
Benzocaine Spectrum BE130
Ethanol Fisher BP2818-4
Methanol Fisher A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder Fisher BP661-50
Bovine serum albumen Fisher BP1600-100
Triton X-100 Fisher BP151-500
3D mini rocker, model 135 Denville Scientific 57281
Goat serum, New Zealand origin Invitrogen 16210064
Sodium azide Fisher S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit MBL PM005 Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21428 Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate Corning 7220-85
Benzyl benzoate Fisher 105862500 Optional – for clearing embryos
Benzyl alcohol Fisher A396-500 Optional – for clearing embryos

References

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Cite This Article
DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V., Miller, R. K. Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J. Vis. Exp. (111), e53799, doi:10.3791/53799 (2016).

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