Summary

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em>アフリカツメガエル</em>腎臓

Published: May 03, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Abstract

アフリカツメガエル (カエル)の胚腎臓は、前腎は、単一ネフロンから構成されており、腎疾患のモデルとして使用することができる。 アフリカツメガエル胚は、外部開発、大型であり、かつ容易に微量注入または外科的処置によって操作することができます。また、運命のマップは初期のアフリカツメガエル胚のために確立されています。最終的に関心のある器官または組織に上昇を与える個々の割球への標的型マイクロインジェクションは、選択的胚の残りの二次的影響を減少させること、この制限領域内の遺伝子発現を過剰発現またはノックダウンするために使用することができます。このプロトコルでは、我々は4と8細胞胚の特定の割球へのマイクロインジェクションを介して、開発アフリカツメガエルの腎臓(前腎)を、標的とするために設立されたアフリカツメガエルの運命マップを利用する方法について説明します。系統トレーサーの注入は、注入の特異的標的の検証を可能にします。胚は38ステージに開発した後 – 40を、ホールマウント免疫染色は前腎の開発を可視化するために使用され、前腎への標的細胞による寄与を評価することができます。同技術は、前腎に加えて他の組織タイプを標的とするように適合させることができます。

Introduction

アフリカツメガエル胚腎臓、前腎は、腎臓の開発と疾患を研究するための優れたモデルです。胚は、外部開発サイズが大きく、大量に製造することができ、かつ容易に微量注入または外科的処置を介して操作されます。また、哺乳類や両生類における腎臓発生を支配する遺伝子が保存されています。胚両生類は前腎を持っており、大人の両生類は後腎を持っていながら、前腎、中腎、および後腎1:哺乳類の腎臓は三つの段階を経て進行します。これらの腎臓形の基本フィルタリング部はネフロンで、両方の哺乳類や両生類は腎形成2、3を受けるために、同じシグナル伝達カスケードおよび誘導のイベントを必要としている。 アフリカツメガエルの前腎は、近位の単ネフロン、中間遠位端との接続細管が含まれ、 (哺乳動物の糸球体に類似)とグロムス1、4-6( 図1 </strオング>)。 アフリカツメガエルの前腎に存在する単一の大きなネフロンは腎臓の開発と疾患過程に関与する遺伝子の研究のための単純なモデルとして、それが適しています。

細胞運命マップは初期のアフリカツメガエル胚のために設立され、Xenbase 7-11オンラインで自由にご利用いただけますされています。同技術は、心臓や目などの他の組織を標的とするように適合させることができるが、ここでは、発展途上アフリカツメガエル前腎を対象とする系統のトレーサーのマイクロインジェクションのための技術が記載されています。リネージュトレーサーは、開発中にその細胞の子孫の可視化を可能にする、初期の割球に注入することができる(生体染色色素を含む、蛍光標識されたデキストラン、組織化学的に検出可能な酵素、およびmRNAは、蛍光タンパク質をコードする)ラベルです。このプロトコルは、系統のトレーサーとして膜対象と赤色蛍光タンパク質12をコードする、MEM-RFPのmRNAを利用しています。対象となるマイクロインジェクション技術ここで説明した4および8細胞胚における個々の割球のためのniquesは、目的の遺伝子を過剰発現するように遺伝子発現、または外因性RNAとをノックダウンするモルフォリノの注射のために利用することができます。腹側、植物割球に注入することにより、主に胚の前腎が発育コントロールとして、対前腎を残して、標的にされるであろう。トレーサーの同時注射は正しい割球を注入し、胚における組織ショーは前腎のターゲティングを検証し、注入された割球から生じたかどうかを確認します。前腎の免疫染色は、前腎細管が標的にされているどれだけの可視化を可能にします。過剰発現およびノックダウン効果は、その後発達対照として胚の反対側に対してスコア付けすることができ、前腎指標13を計算するために使用することができます。細胞運命マップの利用可能性は、この標的マイクロインジェクション技術はOTH組織を標的化するために使用されることを可能にしますえー前腎、および蛍光トレーサーの同時注射よりも、各組織を標的とするマイクロインジェクション分析する前に確認することができます。

胚のマイクロインジェクションの間に、発達の温度はアフリカツメガエルの開発の速度が14に大きく依存することを考えると、厳密に調節されるべきです。開発時間が遅くなるため、4および8細胞注射のために – (16°C 14)胚は低い温度でインキュベートされるべきです。 16で3ステージする°Cの開発時間は約4時間である22℃で、3(4細胞)ステージの段階1(1セル)から現像時間は、約2時間です。これは、22℃で8細胞(ステージ4)胚に4細胞期胚から行くのに約15分かかりますが、16℃で約30分かかります。同様に、22℃で、それだけで16細胞期胚(ステージ5)に進むに8細胞期胚のために30分かかります。この時間は、16℃で45分間に増加されます。ザrefore、胚、16細胞期に進行する前に8細胞期での注射のために十分な時間を可能にするために胚の発達の速度を遅くするのに有用です。腎臓が完全に発達するまでさらに、成長温度、速度または遅い胚発生を調節することができます。

オタマジャクシ期アフリカツメガエル胚の表皮は、郭清または組織15のクリアせずに開発する前腎の容易なイメージングを可能にする、比較的透明です。 アフリカツメガエル胚の相対的な透明度に、ライブセルイメージングはまた、16,17実現可能です。前腎 ​​を可視化するために免疫染色ホールマウント近位にラベルを確立する抗体、ステージの中間、遠位端と接続する細管38で可能です- アフリカツメガエル18-20における遺伝子発現の標的操作の後に前腎開発の評価を可能にする40の胚。

Protocol

以下のプロトコルは、施設ケアと使用委員会(:HSC-AWC-13から135のプロトコル番号)として機能し、実験動物医学動物福祉委員会、のためのヒューストンのセンターでテキサス大学健康科学センターによって承認されています。 腎臓を標的とする注射用の1割球の同定および選択を胚を生成する前に、胚における初期の細胞分裂の方向性を理解するために、アフリカツメガエル<…

Representative Results

MEM-RFP mRNAと4と8細胞アフリカツメガエル胚のマイクロインジェクションは、前腎への標的の異なるレベルを示す。図4に示すステージ正しいMEM-RFPのmRNAの発現パターンを有する40胚を図 。胚は、左の腹側割球( 図4A)に注入し、MEM-RFPのmRNAの適切な発現パターンのために選別しました。近位にMEM-RFPを発現していることに加え?…

Discussion

アフリカツメガエル胚の開発の前腎を標的とすることは識別し、正しい割球を注入することに依存しています。 8細胞胚のV2の割球の注入は、左の前腎18を対象としています。これは、内部​​コントロールとして、反対側の右側前腎を残します。モルホリノは、ノックダウンまたはRNAの過剰発現は、腎臓の発達を変更するために使用されている場合、反対側の右側前?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、テキサス大学のマクガバン医学部小児科から健康NIDDK助成金(K01DK092320)とスタートアップ資金の国立研究所によってサポートされていました。

Materials

Sodium chloride Fisher S271-3
Potassium chloride Fisher P217-500
Magnesium sulfate  Fisher M63-500
Calcium chloride Fisher C79-500
HEPES Fisher BP310-500
EDTA Fisher S311-500
Gentamycin solution, 50 mg/mL Amresco E737-20ML
L-Cysteine, 99%+ Acros Organics 52-90-4
Ficoll Fisher BP525-100
100 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875712
Mini Fridge II Boekel 260009 Benchtop incubator for embryos.
Gap43-RFP plasmid For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006.
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. Invitrogen D1817 Tracer.
Molecular biology grade, USP sterile purified water Corning 46-000-CI
7" Drummond replacement tubes Drummond 3-000-203-G/XL Microinjection needles.
Needle puller Sutter Instruments P-30
Fine forceps Dumont 11252-30 For breaking microinjection needle tip.
Nanoject II Drummond 3-000-204 Microinjector.
Mineral oil, heavy Fisher CAS 8042-47-5 Oil for needles.
27G monoject hypodermic needle Covidien 8881200508 For loading mineral oil into microinjection needle.
5 mL Luer-Lok syringe BD 309646 For loading mineral oil into microinjection needle.
60 mm x 15 mm Petri dish Fisher FB0875713A
800 micron polyester mesh Small Parts CMY-0800-C
Transfer pipets Fisher 13-711-7M For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette.
6-well cell culture plate Nest Biotechnology
MOPS Fisher BP308-500
EGTA Acros Organics 67-42-5
Formaldehyde Fisher BP531-500
15 mm x 45 mm screw thread vial Fisher 03-339-25B For fixing, staining, and storing embryos.
24-well cell culture plate Nest Biotechnology
Benzocaine Spectrum BE130
Ethanol Fisher BP2818-4
Methanol Fisher A412-4
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder Fisher BP661-50
Bovine serum albumen Fisher BP1600-100
Triton X-100 Fisher BP151-500
3D mini rocker, model 135 Denville Scientific 57281
Goat serum, New Zealand origin Invitrogen 16210064
Sodium azide Fisher S227I-25
Monoclonal 3G8 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label proximal tubules.
Monoclonal 4A6 antibody European Xenopus Resource Centre Primary antibody to label distal tubule and duct.
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit MBL PM005 Primary antibody to label Gap43-RFP tracer.
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Life Technologies A11001 Secondary antibody to label distal tubule and duct.
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Life Technologies A21428 Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer.
9 cavity spot plate Corning 7220-85
Benzyl benzoate Fisher 105862500 Optional – for clearing embryos
Benzyl alcohol Fisher A396-500 Optional – for clearing embryos

References

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Cite This Article
DeLay, B. D., Krneta-Stankic, V., Miller, R. K. Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney. J. Vis. Exp. (111), e53799, doi:10.3791/53799 (2016).

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