Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em> Xenopus</em> Kidney
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
O rim embrionário de Xenopus laevis (rã), os pronephros, consiste de uma única nefrónio, e pode ser usado como um modelo para a doença renal. Embriões de Xenopus são grandes, desenvolvem externamente, e pode ser facilmente manipulado por microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, mapas destino foram estabelecidas para embriões de Xenopus. microinjecção alvejado no blast�ero indivíduo que irá, eventualmente, dar origem a um órgão ou tecido de interesse pode ser utilizado para sobre-expressar selectivamente ou derrubar a expressão do gene restrita dentro desta região, diminuição dos efeitos secundários no resto do embrião em desenvolvimento. Neste protocolo, descrevemos como utilizar estabelecidos mapas destino Xenopus para atingir o Xenopus rim em desenvolvimento (os pronephros), por microinjecção blastomere específico de embriões de células 8 4 e. A injecção de marcadores de linhagem permite a verificação de uma orientação mais precisa da injecção.Depois de embriões se desenvolveram para encenar 38-40, todo-mount imuno é usado para visualizar o desenvolvimento pronephric, ea contribuição de células-alvo para os pronephros pode ser avaliado. A mesma técnica pode ser adaptada para outros tipos de tecidos alvo para além dos pronephros.
Introduction
O rim embrionário de Xenopus, as pronephros, é um bom modelo para o estudo do desenvolvimento e doença renal. Os embriões desenvolvem externamente, são grandes em tamanho, podem ser produzidos em grandes números, e são facilmente manipulados através de microinjecção ou procedimentos cirúrgicos. Além disso, os genes que regulam o desenvolvimento do rim em mamíferos e anfíbios são conservados. Rins de mamíferos progredir através de três etapas: a pronephros, mesonephros e metanephros 1, enquanto anfíbios embrionárias têm um pronephros e anfíbios adultos têm um metanephros. A unidade de filtragem básica dessas formas de rim é o néfron, e ambos os mamíferos e anfíbios exigir os mesmos cascatas de sinalização e eventos indutivos se submeter nefrogênese 2, 3. Os pronephros Xenopus contém um único néfron composto por proximal, intermediário, distal e conectando túbulos, e um Glomus (análogo ao do glomérulo de mamífero) 1, 4-6 (Figura 1 </strong>). A única, grande nefrónio presente nas pronephros Xenopus torna-o adequado como um modelo simples para o estudo de genes envolvidos em processos de desenvolvimento renal e doença.
Mapas celular fate foram estabelecidas para embriões de Xenopus, e estão disponíveis gratuitamente on-line em Xenbase 7-11. Aqui, nós descrevemos uma técnica para microinjecção de marcadores de linhagem para direccionar o desenvolvimento de Xenopus pronephros, embora a mesma técnica pode ser adaptado para outros tecidos alvo tais como o coração ou olhos. marcadores de linhagem são etiquetas (incluindo corantes vitais, dextranos marcados com fluorescência, enzimas detectáveis histoquimicamente, e ARNm que codificam as proteínas fluorescentes) que pode ser injectado num blastómero cedo, permitindo a visualização da descendência da célula que durante o desenvolvimento. Este protocolo utiliza MEM-RFP ARNm, membrana alvo que codifica a proteína fluorescente vermelha 12, como um marcador de linhagem. A tecnologia de microinjeção alvonicas para blastómeros individuais em embriões de células 4- 8 e descritas aqui podem ser utilizadas para injecção com morpholinos para derrubar a expressão do gene, ou com RNA exógeno para sobre-expressar um gene de interesse. Ao injectar no blast�ero ventral, vegetal, principalmente as do embrião pronephros vai ser alvo, deixando os pronephros contralaterais como um controlo do desenvolvimento. Co-injeção de um traçador verifica se o blastomere correta foi injetado, e mostra que os tecidos no embrião surgiu a partir da blastomere injetado, verificando a segmentação dos pronephros. Imunocoloração das pronephros permite a visualização de quão bem os túbulos pronephric foram alvejados. A sobre-expressão e efeitos de knockdown pode então ser marcado contra o lado contralateral do embrião, o qual serve como um controlo de desenvolvimento, e podem ser usados para calcular o índice pronephric 13. A disponibilidade de mapas destino celular permite que esta técnica de microinjecção objectivo de ser utilizada para os tecidos alvo othER do que os pronephros, e a co-injecção de um traçador fluorescente permite a micro-injecção direccionada para cada tecido a ser verificada antes da análise.
Durante a microinjeção de embriões, a temperatura de desenvolvimento deve ser regulamentado firmemente, dado que a taxa de desenvolvimento de Xenopus é altamente dependente dele 14. Os embriões devem ser incubados a temperaturas mais baixas (14 – 16 ° C) para as injecções de células-4- 8 e porque o tempo de desenvolvimento é abrandado. A 22 ° C, o tempo de desenvolvimento de uma fase (1 célula) a fase 3 (4 células) é de aproximadamente 2 horas, enquanto que o tempo de desenvolvimento de 16 ° C para a fase 3 é de aproximadamente 4 horas. Demora cerca de 15 minutos para ir de um embrião de 4 células para uma célula-8 (etapa 4) de embriões a 22 ° C, mas demora cerca de 30 minutos a 16 ° C. Do mesmo modo, a 22 ° C, leva apenas 30 minutos para um embrião de 8 células de progredir para uma célula embrionária 16 (etapa 5). Este tempo é aumentado para 45 minutos a 16 ° C. oguinte, que é útil para diminuir a taxa de desenvolvimento dos embriões para permitir tempo suficiente para injecções na fase de 8 células antes de os embriões progredir para a fase de 16 células. Além disso, as temperaturas de crescimento pode ser modulada para acelerar ou retardar o desenvolvimento embrionário até o rim foi totalmente desenvolvido.
A epiderme de girino em estágio embriões de Xenopus é relativamente transparente, permitindo a fácil imagem dos pronephros em desenvolvimento sem dissecção ou compensação do tecido 15. Devido à relativa transparência de embriões de Xenopus, imagens de células vivas também é viável 16,17. Todo-mount imunocoloração para visualizar as pronephros é possível com anticorpos estabelecidos que rotulam o proximal, intermediário, distal e túbulos de ligação de fase 38 – 40 embriões que permitem a avaliação do desenvolvimento pronephric depois alvo de manipulação da expressão do gene em embriões de Xenopus 18-20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Segmentação as pronephros de desenvolvimento de embriões de Xenopus se baseia na identificação e injetar o blastomere correta. A injecção do blastómero V2 embriões de 8 células alvo os pronephros esquerda 18. Isso deixa os pronephros direito contralateral como um controlo interno. Se morfolino knockdown ou sobre-expressão de ARN é utilizada para alterar o desenvolvimento do rim, os pronephros direito contralaterais pode ser usado para comparar os efeitos de silenciamento de genes ou a sob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma National Institutes of Health subvenção NIDDK (K01DK092320) e financiamento de arranque do Departamento de Pediatria da Universidade do Texas McGovern Medical School.
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
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