Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему<em> Xenopus</em> почки
Summary
Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Abstract
Эмбриональной почки из Xenopus Laevis (лягушки), предпочки, состоит из одного нефрона, и может быть использован в качестве модели для заболевания почек. Xenopus эмбрионы велики, развиваются внешне, и можно легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургическими процедурами. Кроме того, карты судьбы были установлены для ранних эмбрионов Xenopus. Целенаправленное микроинъекции в индивидуальную бластомере, которые в конечном счете приводят к возникновению органа или ткани интерес может быть использован для селективного гиперэкспрессией или сбить экспрессию генов в этой ограниченной области, уменьшение вторичных эффектов в остальной части развивающегося эмбриона. В этом протоколе мы опишем , как использовать установленные карты судьбы Xenopus целевой развивающийся Xenopus почки (Предпочка) через микроинъекции в конкретные бластомере 4- и 8-клеточных эмбрионов. Инъекции линиджа трассеров позволяет проверить конкретного нацеливания инъекции.После того, как зародыши развились до стадии 38 – 40, в целом монтажа иммуноокрашивания используется для визуализации pronephric развития, а также вклад целевых клеток к предпочки могут быть оценены. Тот же метод может быть адаптирован в отношении других типов тканей, в дополнение к предпочки.
Introduction
Xenopus эмбриональной почки, Предпочка, является хорошей моделью для изучения развития почек и болезней. Эмбрионы развиваются внешне, имеют большие размеры, могут быть получены в больших количествах, и легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургических процедур. Кроме того, гены, регулирующие развитие почек у млекопитающих и земноводных сохраняются. Млекопитающие почки прогрессировать через три этапа: Предпочка, мезонефроса и 1 вторичной почки, в то время как эмбриональные амфибии имеют Предпочка и взрослые амфибии имеют вторичной почки. Основная фильтрация единица этих форм почек является нефрон, и оба млекопитающих и земноводных требуют те же сигнальные каскады и индуктивные события пройти нефрогенеза 2, 3. Предпочка Xenopus содержит один нефрона , состоящий из проксимального, промежуточного, дистальной и соединительной трубочки, и гломусных (аналог клубочках млекопитающих) 1, 4-6 (рис 1 </strОнг>). Один большой нефрона присутствует в предпочки Xenopus делает его пригодным в качестве простой модели для изучения генов , участвующих в процессах развития почек и болезней.
Карты судьбы клеток были созданы для ранних эмбрионов Xenopus, и находятся в свободном доступе в Интернете по адресу Xenbase 7-11. Здесь мы описываем технику для микроинъекции линиджа трассеров для нацеливания развивающиеся Xenopus пронефрос, хотя и тот же метод может быть адаптирован к целевой других тканей , таких как сердце или глаз. Lineage трейсеры ярлыки (в том числе жизненно важных красителей, флуоресцентно меченных декстранов, гистохимического обнаруживаемых ферментов и мРНК, кодирующие флуоресцентные белки), которые могут быть введены в раннем бластомере, что позволяет визуализировать потомству этой клетки в процессе разработки. Этот протокол использует MEM-RFP мРНК, кодирующий мембранный целевой красный флуоресцентный белок 12, как клонального трассера. Целенаправленное микроинъекции технологийniques для отдельных бластомеров в 4- и 8-клеточных эмбрионов, описанных здесь, могут быть использованы для инъекций с Morpholinos, чтобы сбить экспрессию гена или экзогенной РНК гиперэкспрессией гена интерес. Путем введения в брюшную, вегетативного бластомере, в первую очередь Предпочка эмбриона будут направлены, в результате чего контралатеральной Предпочка в качестве контроля развития. Co-инъекция трассера проверяет, правильно бластомеров инъецируют, и показывает, какие ткани в эмбрионе возникла из введенного бластомере, проверяя адресности предпочки. Иммуноокрашивание предпочки позволяет визуализировать, как хорошо pronephric трубочки были направлены. Избыточной экспрессии и нокдаун эффекты затем может быть забит против контралатеральной стороне эмбриона, который служит в качестве контроля развития, и может быть использовано для вычисления pronephric 13 индекса. Наличие клеточной судьбы карты позволяет этому целенаправленный метод микроинъекции быть использована для целевых тканей OTHэр чем предпочки и совместной инъекции флуоресцентного индикатора позволяет направленно микроинъекции в каждой ткани, чтобы быть проверены перед проведением анализа.
Во время эмбрионального микроинъекции, температура развития должна регулироваться плотно, учитывая , что темпы развития Xenopus сильно зависит от него 14. Эмбрионы следует инкубировать при более низких температурах (14 – 16 ° С) в течение 4- и 8-клеточных инъекций, так как время развития замедляется. При 22 ° С, время разработки от стадии 1 (1) клетки к стадии 3 (4 ячейки) составляет приблизительно 2 часа, в то время как 16 время разработки ° C до стадии 3 составляет около 4 часов. Она занимает около 15 минут, чтобы перейти от 4-клеточного эмбриона к 8-элементная (стадия 4) эмбриона при 22 ° С, но занимает примерно 30 минут при 16 ° С. Аналогичным образом, при 22 ° С, это займет всего 30 минут для 8-клеточного эмбриона прогрессировать до 16-клеточного эмбриона (стадия 5). На этот раз увеличивается до 45 минут при 16 ° С.refore, полезно, чтобы замедлить скорость развития эмбрионов, чтобы дать достаточно времени для инъекций на 8-клеточной стадии, прежде чем эмбрионы прогрессировать до 16-клеточной стадии. Кроме того, температура роста можно модулировать, чтобы ускорить или замедлить развитие эмбриона, пока почки не полностью развита.
Эпидермис головастика стадии Xenopus эмбрионов является относительно прозрачным, что позволяет легко визуализации развивающихся предпочки без рассечения или очистки ткани 15. Из – за относительной прозрачности Xenopus эмбрионов, получение изображений живых клеток также возможно 16,17. Всего монтажа иммунным для визуализации Предпочка можно с установленными антителами , которые маркируют проксимальный, средний, дальний и подсоединению канальцы стадии 38 – 40 эмбрионов , которые позволяют для оценки pronephric развития после целенаправленного воздействия генной экспрессии в Xenopus эмбрионов 18-20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ориентация Предпочка развивающихся эмбрионов Xenopus опирается на выявление и введение правильного бластомера. Инъекция V2 бластомере 8-клеточных эмбрионов ориентирована на левый Предпочка 18. Это оставляет контралатеральной правильные Предпочка в качестве внутреннего контро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения гранта NIDDK (K01DK092320) и финансирование запуска из отдела педиатрии в Университете штата Техас Макговерна медицинской школы.
Materials
| Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| EDTA | Fisher | S311-500 | |
| Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
| L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
| Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
| 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
| Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
| Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
| Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
| Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
| 7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
| Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
| Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
| Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
| 27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| 800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
| Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
| 6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| MOPS | Fisher | BP308-500 | |
| EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
| 15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
| Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
| Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| 3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
| Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
| Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
| Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
| Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
| anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
| 9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
| Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
| Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |
References
- Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
- Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
- Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, 73-74 (2002).
- Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
- Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84 (2008).
- Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
- Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
- Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann’s Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
- Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
- Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
- Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms’ tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , (2000).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. , 215-238 (2014).
- Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
- Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
- Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
- Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
- Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D., Kloc, M., Kubiak, J. Z. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. , (2014).
- Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
- Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
- Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
- Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
- Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
- Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).
- Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
- Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
- Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).
