Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.
Den embryoniske nyre fra Xenopus laevis (frosk), den pronephros, består av et enkelt nevronet, og kan brukes som en modell for nyresykdom. Xenopus embryoer er store, utvikle eksternt, og kan lett manipuleres ved mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er det etablert skjebne kart for tidlig Xenopus embryo. Målrettet mikroinjeksjon inn i de enkelte blastomere som til slutt vil gi opphav til et organ eller vev av interesse kan bli brukt for selektivt å overuttrykke eller slå ned genekspresjon innenfor dette begrensede område, reduseres sekundære effekter på resten av utvikling av embryo. I denne protokollen beskriver vi hvordan du kan utnytte etablerte Xenopus skjebne kart å målrette utvikle Xenopus nyre (de pronephros), gjennom mikroinjeksjon inn i spesifikke blastomere av 4- og 8-cellers embryoer. Injeksjon av avstamning tracere tillater verifisering av den spesifikke målrettingen av injeksjonen.Etter embryo har utviklet for å iscenesette 38-40, hel-mount farging brukes til å visualisere pronephric utvikling, og bidraget av målrettede celler til pronephros kan vurderes. Den samme teknikken kan tilpasses for å målrette andre typer vev i tillegg til pronephros.
Xenopus embryoniske nyre, de pronephros, er en god modell for å studere nyre utvikling og sykdom. Embryoene utvikle eksternt, er store i størrelse, kan fremstilles i stort antall, og kan lett manipuleres via mikroinjeksjon eller kirurgiske prosedyrer. I tillegg er de gener som regulerer nyre utvikling hos pattedyr og amfibier bevart. Pattedyr nyrene går gjennom tre stadier: de pronephros, mesonephros og metanephros 1, mens embryonale amfibier har en pronephros og voksne amfibier har en metanephros. Den grunnleggende filtrering enhet av disse nyre formene er nevronet, og både pattedyr og amfibier krever de samme signalkaskader og induktive arrangementer for å gjennomgå nephrogenesis to, tre. Xenopus pronephros inneholder et enkelt nephron sammensatt av proksimale, middels, distal og kobler tubuli, og en glomus (analog til pattedyr glomerulus) 1, 4-6 (Figur 1 </strong>). Den eneste, stor nevronet tilstede i Xenopus pronephros gjør den egnet som en enkel modell for studiet av gener som er involvert i nyre utviklings- og sykdomsprosesser.
Cell skjebne kart er etablert for tidlig Xenopus embryo, og er fritt tilgjengelig online på Xenbase 7-11. Her beskriver vi en teknikk for mikroinjeksjon av avstamning tracere å målrette utviklings Xenopus pronephros, selv om den samme teknikken kan tilpasses målrette andre vev som hjerte eller øynene. Linjesporstoff etiketter (inkludert vitale farvestoffer, fluorescerende merkede dekstraner, histochemically detekterbare enzymer, og mRNA som koder for fluorescerende proteiner) som kan injiseres inn i en tidlig blastomere, som tillater visualisering av avkommet av cellen i løpet av utviklingen. Denne protokollen benytter MEM-RFP mRNA, som koder for membran målrettet rød fluorescerende protein 12, som en avstamning tracer. Den målrettede mikroinjeksjon techteknikker for individuelle blastomeres i 4- og 8-cellers embryo som er beskrevet her kan benyttes for injeksjon med morpholinos å slå ned genekspresjon, eller med eksogen RNA til overuttrykker et gen av interesse. Ved å injisere inn i ventral, vegetal blastomere, først og fremst pronephros av embryoet vil være målrettet, forlater kontralaterale pronephros som en utviklingsmessig kontroll. Samtidig injeksjon av en tracer bekrefter at riktig blastomere ble injisert, og viser hvilke vev i fosteret oppsto fra den injiserte blastomere, verifisere målretting av pronephros. Farging av pronephros tillater visualisering av hvor godt pronephric tubuli har vært målrettet. Overekspresjon og knockdown effekter kan deretter scoret mot motsatt side av embryoet, som fungerer som en utviklingsmessig kontroll, og kan brukes til å beregne pronephric indeksen 13. Tilgjengeligheten av celle skjebne kartene tillater dette målrettet mikroinjeksjonsteknikk som kan brukes til å målrette vev klienEr enn pronephros, og co-injeksjon av et fluorescerende sporstoff gjør at målrettet mikroinjeksjon til hver vev som skal verifiseres før analyse.
Under embryo mikroinjeksjon, bør utviklings temperatur reguleres strengt, gitt at frekvensen av Xenopus utviklingen er svært avhengig av det 14. Embryoet skal inkuberes ved kjøligere temperaturer (14-16 ° C) for 4- og 8-cellers injeksjoner fordi utviklingstiden er bremset ned. Ved 22 ° C, utviklingstiden fra trinn 1 (en celle) for å iscenesette 3 (4 celler) er ca 2 timer, mens ved 16 ° C utviklingstiden til scenen tre er ca 4 timer. Det tar ca 15 minutter å gå fra en 4-cellers embryo til en 8-cellers (stadium 4) embryo ved 22 ° C, men tar ca 30 minutter ved 16 ° C. Tilsvarende ved 22 ° C, det tar bare 30 minutter for en 8-cellers embryo for å utvikle seg til en 16-cellers embryo (trinn 5). Denne tiden økte til 45 minutter ved 16 ° C. Derefore, er det nyttig å bremse utviklingen til embryoene for å muliggjøre tilstrekkelig tid for injeksjon ved 8-cellestadiet før embryoene videre til 16-cellestadiet. I tillegg kan veksttemperaturer moduleres å fremskynde eller forsinke embryoutvikling til nyrene har fullt utviklet.
Epidermis av rumpetroll-trinns Xenopus embryo er relativt gjennomsiktig, noe som åpner for enkel bildebehandling av utviklings pronephros uten disseksjon eller clearing av vevet 15. På grunn av den relative åpenhet av Xenopus embryo, er levende celle bildebehandling også mulig 16,17. Hel-mount farging å visualisere de pronephros er mulig med etablerte antistoffer som merker den proksimale, middels, distal og kobler tubuli av scene 38 – 40 embryoer som gir mulighet for vurdering av pronephric utvikling etter målrettet manipulering av genuttrykk i Xenopus embryo 18-20.
Rettet mot pronephros for å utvikle Xenopus embryo er avhengig av å identifisere og injisere riktig blastomere. Injeksjon av V2 blastomere av 8-cellers embryo rettet mot venstre pronephros 18. Dette etterlater kontralaterale riktige pronephros som en intern kontroll. Hvis morfolino knockdown eller RNA overekspresjon brukes til å endre nyre utvikling, kan kontralaterale riktige pronephros brukes til å sammenligne effekten av genet knockdown eller overekspresjon til venstre pronephros. I dette tilf…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et National Institutes of Health NIDDK stipend (K01DK092320) og oppstart finansiering fra Institutt for Pediatrics ved University of Texas McGovern Medical School.
Sodium chloride | Fisher | S271-3 | |
Potassium chloride | Fisher | P217-500 | |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | |
HEPES | Fisher | BP310-500 | |
EDTA | Fisher | S311-500 | |
Gentamycin solution, 50 mg/mL | Amresco | E737-20ML | |
L-Cysteine, 99%+ | Acros Organics | 52-90-4 | |
Ficoll | Fisher | BP525-100 | |
100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875712 | |
Mini Fridge II | Boekel | 260009 | Benchtop incubator for embryos. |
Gap43-RFP plasmid | For making tracer RNA. Ref: Davidson et al., 2006. | ||
Rhodamine dextran, 10,000 M.W. | Invitrogen | D1817 | Tracer. |
Molecular biology grade, USP sterile purified water | Corning | 46-000-CI | |
7" Drummond replacement tubes | Drummond | 3-000-203-G/XL | Microinjection needles. |
Needle puller | Sutter Instruments | P-30 | |
Fine forceps | Dumont | 11252-30 | For breaking microinjection needle tip. |
Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | Microinjector. |
Mineral oil, heavy | Fisher | CAS 8042-47-5 | Oil for needles. |
27G monoject hypodermic needle | Covidien | 8881200508 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
5 mL Luer-Lok syringe | BD | 309646 | For loading mineral oil into microinjection needle. |
60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher | FB0875713A | |
800 micron polyester mesh | Small Parts | CMY-0800-C | |
Transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | For transferring embryos. Cut off the tip so that the embryos are easily taken up by the pipette. |
6-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
MOPS | Fisher | BP308-500 | |
EGTA | Acros Organics | 67-42-5 | |
Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | |
15 mm x 45 mm screw thread vial | Fisher | 03-339-25B | For fixing, staining, and storing embryos. |
24-well cell culture plate | Nest Biotechnology | ||
Benzocaine | Spectrum | BE130 | |
Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
Methanol | Fisher | A412-4 | |
Phosphate buffered saline (PBS) 1X powder | Fisher | BP661-50 | |
Bovine serum albumen | Fisher | BP1600-100 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
3D mini rocker, model 135 | Denville Scientific | 57281 | |
Goat serum, New Zealand origin | Invitrogen | 16210064 | |
Sodium azide | Fisher | S227I-25 | |
Monoclonal 3G8 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label proximal tubules. | |
Monoclonal 4A6 antibody | European Xenopus Resource Centre | Primary antibody to label distal tubule and duct. | |
anti-RFP pAb, purified IgG/rabbit | MBL | PM005 | Primary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11001 | Secondary antibody to label distal tubule and duct. |
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21428 | Secondary antibody to label Gap43-RFP tracer. |
9 cavity spot plate | Corning | 7220-85 | |
Benzyl benzoate | Fisher | 105862500 | Optional – for clearing embryos |
Benzyl alcohol | Fisher | A396-500 | Optional – for clearing embryos |