Odla Primär Nasal epitelceller från barn och programmera in inducerade pluripotenta stamceller

Summary

This publication demonstrates methods for successful sampling and culture of nasal epithelial mucosa from children, and reprogramming these cells to induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs).

Abstract

Nasal epithelial cells (NECs) are the part of the airways that respond to air pollutants and are the first cells infected with respiratory viruses. They are also involved in many airway diseases through their innate immune response and interaction with immune and airway stromal cells. NECs are of particular interest for studies in children due to their accessibility during clinical visits. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have been generated from multiple cell types and are a powerful tool for modeling human development and disease, as well as for their potential applications in regenerative medicine. This is the first protocol to lay out methods for successful generation of iPSCs from NECs derived from pediatric participants for research purposes. It describes how to obtain nasal epithelial cells from children, how to generate primary NEC cultures from these samples, and how to reprogram primary NECs into well-characterized iPSCs. Nasal mucosa samples are useful in epidemiological studies related to the effects of air pollution in children, and provide an important tool for studying airway disease. Primary nasal cells and iPSCs derived from them can be a tool for providing unlimited material for patient-specific research in diverse areas of airway epithelial biology, including asthma and COPD research.

Introduction

Inducerade pluripotenta stamceller från mänskliga prover (hiPSCs) är en snabbt växande teknik stamcellsforskning. De erbjuder ett alternativ till embryonal stamcells (hESC) forskning med betydligt färre etiska och moraliska nackdelar ^1,2. Även om de inte är epigenetiskt identiska med hESCs ^3-5, hiPSCs erbjuder ett unikt sätt att modellera utveckling och sjukdom fenotyper, och de kan härledas från vävnader som är relevanta för sjukdomstillståndet ^5-8. Nya metoder för att generera hiPSCs ständigt undersökas för att identifiera optimala celltyper till att börja med, som ett sätt att förbereda GMP-kvalitet iPSCs lämpliga för transplantation, och även för att öka aktualiteten och effektivitet omprogrammering processen ^6,9-11.

Airway epitelceller är avgörande för utvecklingen av allergisk inflammation ¹² och epitelet är en viktig drivkraft för allergiska reaktioner och luftvägs ombyggnad genom interaktion med Immune och stromaceller. Den luftvägsepitel spelar en viktig roll för uppkomsten och ihållande lungsjukdomar såsom astma. Dock lägre luftvägsepitelceller är svåra att få i en klinisk miljö, särskilt från friska kontrollpatienter och barn. Data från flera studier stöder antagandet att epitelceller från nässlemhinnan är en giltig och praktisk proxy för lägre luftvägs epitelceller ^13-20, speciellt när man studerar svar på luftföroreningar och allergener. Nässlemhinnan består av mer än 90% flimmer epitelceller i luftvägarna och provtagning dessa nasala epitelceller (Pass) kan lätt utföras på barn så unga som fyra års ålder eller fem, eftersom det är mindre invasiv än andra cell / vävnadsprovtagningsteknik och är förknippade med minimal risk för biverkningar såsom infektion ^20-23. Det erbjuder en snabb och enkelt sätt att prova både friska och sjuka barn utan långa, onödiga och ofta smärtsam bronkoskopi procedures som kräver sedering. Tidigare studier har visat att sjukdomstyper relaterade till astma svårighetsgrad kan urskiljas i både nässlemhinnan samt bronkial cellprover tagna från astmatiska barn, och genuttryck mellan de två vävnadstyper var likartad i ca 90% av icke-ubiquitous gener ^{22 , 24.} Som en källa för iPSCs, NEC erbjuder fördelar över andra ofta utnyttjade celltyper. Fibroblaster används ofta för iPSC generation, men även om dessa celler lätt kan odlas från en hudbiopsi, denna process kräver typiskt lokalbedövning, en incision, och suturer, och är associerad med en viss risk för infektion. Därför kan erhålla informerat samtycke från patienter för denna typ av biopsi vara svårt ^25. Ett alternativ till fibroblaster är perifera mononukleära blodceller (PBMC). Emellertid kan det vara svårt att erhålla tillräckligt med blod för iPSC generering från pediatriska patienter. Dessutom finns det begränsningar av nedströms apkomplikationer för fibroblaster och blodkroppar härledda iPSCs, särskilt deras differentiering förmåga att vissa celltyper ^5,26. Med tanke på den relativa tillgängligheten och den låga risken för biverkningar efter sin samling, NEC representerar en ideal cell källa för iPSC generation från pediatriska populationer.

iPSCs har fått mycket uppmärksamhet på senare tid som en plattform för att studera människans utveckling, genererar nya sjukdomsmodeller och som en potentiell källa till celler för personliga terapier. Innan kan förverkligas den fulla potentialen av denna teknik, de molekylära grunderna för omprogrammeringen processen måste belysas, men nu detta protokoll och de förfaranden som beskrivs i att belysa forskningsstudier fokuserade på luftvägsexponeringar samt ge en plattform för studera effekterna av personlig medicin som involverar iPSCs.

Samverkans arbetet för flera labb har lett till genen av en framgångsrik teknik för att inte bara sampling av nässlemhinnan, utan även odling av NEC och omprogrammering dessa celler till iPSCs ^23. Den här artikeln innehåller en översikt över ett protokoll för optimal provtagning, odling, och omprogrammering förhållanden.

Protocol

Följande protokoll följer de riktlinjer Institutionernas mänskliga forskningsetisk kommitté. 1. Provtagning nässlemhinnan OBS: erhålla prover från patienter som är fria från tecken på andnings virusinfektion. Förbered en 15 ml konisk färsk innan deltagaren besök och tillsätt 2 ml BEGM (bronkialepitelceller cellodlingsmedium) plus 20 pl steril Penn / Strep / Fungizone (P / S / F) (0,01%). Öppna cytologi borste strax före provta…

Representative Results

Den inledande delen av näsan, som kallas den nasala vestibulen, är det område som omges av brosk 29. Borsten måste gå smidigt förbi detta område i näsan, utöver den nasala ventilen (ostium internum, eller "svarta hål" ses på baksidan av Nare), och provet erhålls från sämre turbinata (Figur 1). De nasala näsmusslan är beniga strukturer som ökar ytan av nosen 29, vilket gör dem till en idealisk plats för provtagning. Områ…

Discussion

Nasala epitelceller (Pass) är en lättillgänglig plattform för att studera luftvägssjukdom, och NEC-iPSCs erbjuder en spännande möjlighet att pröva sjukdomsutveckling, behandling och terapi ^1,31,32. NEC kan lätt erhållas utan stressande eller potentiellt skadliga förfaranden ^6,23. I vår erfarenhet, verkar provtagning av nässlemhinnan som beskrivs i detta protokoll att vara mindre stressande och bättre upplevd än blodinsamling för barn. Därför kan denna metod vara särskilt användb…

Materials

15mL conical	Fisher Scientific	14-959-49D	Protocol Step 1.1.
BEGM	Lonza	CC-3170	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep/Fungicide	Life Technologies	15240-062	Protocol Step 1.1.
Penn/Strep	Life Technologies	15140-122	Protocol Step 4.a.
cytosoft cytology brush	Fisher Scientific	22-263-357	Protocol Step 1.2.
trypan blue	Fisher Scientific	MT-25-900-CI	Protocol Step 2.1.
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-54	Protocol Step 2.1.
PBS	Fisher Scientific	BP2438-4	Protocol Step 2.2.
Cytology Funnel Clips	Fisher Scientific	10-357	Protocol Step 2.2.
cytospin funnel	Fisher Scientific	23-640-320	Protocol Step 2.2.
Cytospin 4	Fisher Scientific	A78300003	Protocol Step 2.2.
blank slide	Fisher Scientific	S95933	Protocol Step 2.2.
hema 3 stain kit	Fisher Scientific	22-122-911	Protocol Step 2.2.
Bovine Dermal Colagen, type 1	Life Technologies	A1064401	Protocol Step 3.2.
T25 flask	Fisher Scientific	08-772-45	Protocol Step 3.3.
Trypsin	Lonza	CC-5012	Protocol Step 5.2.
Trypsin Neutralizing Solution	Lonza	CC-5002	Protocol Step 5.2.
Fetal Bovine Serum (FBS), heat sterilized at 65°C for 30min	Sigma-Aldrich	F2442	Protocol Step 5.5.
Dimethyl sulfoxide Hybri-Max™, sterile-filtered, BioReagent, suitable for hybridoma, ≥99.7% -	Sigma-Aldrich	D2650	Protocol Step 5.5.
polycistonic lentivirus*	e.g. Millipore	SCR511	Protocol Step 6.4.  A commercial source of reprogramming vector is listed. We routinely use the 4-in-1 plasmid reported by Voelkel et al (PMID: 20385817) to generate VSV-G-pseudotyped polycistronic reprogramming lentivirus in-house. This plasmid can be obtained by contacting
polybrene	Santa Cruz Biotechnology	sc-134220	Protocol Step 6.4.
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	GSC-6301G	Protocol Step 6.4.
hESC media	See recipe included in protocol		Protocol Step 6.11.
SB431542	Stemgent	04-0010	Protocol Step 6.11.
PD0325901	Stemgent	04-0006	Protocol Step 6.11.
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	Protocol Step 6.11.
hESC-qualified Matrigel	BD Biosciences	354277	Protocol Step 6.13.
Corning plate, 6 well	Fisher Scientific	08-772-1B	Protocol Step 6.13.
mTeSR1	StemCell	5850	Protocol Step 6.13.
250mL disposable filter flask (0.22µm)	Fisher	SCGP-U02-RE
dispase	StemCell	7923	Protocol Step 7.3.
DMEM/F12	Life Technologies	11320-033	Protocol Step 7.3.
cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240	Protocol Step 7.4.
hESC Media**			Protocol Step 6.11. components should be mixed and then filter sterilized. Media can be kept at 4°C for up to two weeks. When warming media, do not leave at 37°C longer than 15 min
DMEM-F12 50/50 media	Invitrogen	11330-032	Final Concentration
KO replacement serum (KO-SR)	Invitrogen	10828-028	0.2
200mM L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1mM
55mM ß-mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	0.1mM
100x non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1x
2ug/mL Basic-Fibroblast Growth Factor (b-FGF)	Invitrogen	13256-029	4ng/mL