जांच के लिए गुणात्मक और मात्रात्मक assays और प्रोटीन antimicrobials की विशेषता
Summary
Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.
Abstract
Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.
Introduction
Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens 1. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition 2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species 4. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population 5.
The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.
The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis 6.
The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.
In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.
Protocol
Representative Results
Discussion
microslide प्रसार परख और डाई रिलीज परख का पता लगाने और पहले से अज्ञात प्रोटीन antimicrobials निस्र्पक के लिए लाभ प्रदान करते हैं। ये तेजी से और संवेदनशील तरीकों हित के एंजाइमों अधिक से अधिक अनुसंधान संसाधनों के निवेश करने से पहले की पहचान के लिए जीव स्रोत पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग अनुमति देते हैं। उच्च प्रोफ़ाइल लक्ष्य एंजाइमों के रूप में पहचाने जाते हैं, पता लगाने assays के रूपांतरों तेजी से एंजाइम का पता लगाने के लिए या एंजाइम की जैव रासायनिक विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक multistep प्रोटीन शुद्धि योजना के दौरान, microslide प्रसार परख तेजी से ब्याज की एंजाइम युक्त भिन्न पता लगा सकते हैं। इसके अलावा, एंजाइम के लिए प्रतिक्रिया ऑप्टिमा डाई रिलीज परख में प्रतिक्रिया buffers और ऊष्मायन तापमान में फेरबदल के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
एंजाइम microslide प्रसार परख में पता लगाने के लिए आवश्यक जन की रेंज एंजाइम characteri का एक समारोह हैStics। परख का पता लगाने सीमाओं आम तौर पर डाई रिहाई परख की तुलना में एंजाइम की उच्च मात्रा के उपयोग की आवश्यकता है। इस अध्ययन में, microslide प्रसार परख (चित्रा 1) डाई रिलीज परख (चित्रा 4) के पता लगाने सीमा की तुलना सचित्र कि microslide प्रसार परख डाई रिहाई परख की तुलना में एक कम संवेदनशील तकनीक है। जब एंजाइम एकाग्रता एक चिंता का विषय नहीं है, microslide परख कम श्रम और उपकरणों की मांग के साथ लक्ष्य substrates के खिलाफ प्रोटीन antimicrobials के उत्पादन के लिए पुस्तकालयों का तेजी से प्रारंभिक जांच के लिए अनुमति देता है। और अधिक प्रयास और उपकरणों की आवश्यकता होती है, डाई रिलीज परख मात्रात्मक परिणाम है कि एक दिया सब्सट्रेट के लिए ही है या अलग अलग एंजाइमों की डाई रिलीज assays के बीच तुलना की अनुमति उपज, अधिक संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। दो तरीकों आसानी से अति विशिष्ट उपकरण के लिए कोई जरूरत के साथ सबसे सूक्ष्मजीवविज्ञानी प्रयोगशालाओं में प्रदर्शन कर रहे हैं। प्रतिनिधि मेंसक्रिय assays, नियंत्रण एंजाइम, α-काइमोट्रिप्सिन, 100 एनजी (चित्रा 5) डाई रिहाई परख का उपयोग कर के रूप में के रूप में कम मात्रा में पता चला है, जबकि कम से कम microslide प्रसार परख में पता चला राशि 1 माइक्रोग्राम (नहीं दिखाया डेटा) था।
रोगाणुरोधी एंजाइमों के लिए एक गुणात्मक परख का पता लगाने के रूप में उपयोगिता प्रदान करना, प्रसार परख के रूपांतरों के एक नंबर 11,13 सूचना दी गई है। इन assays की समीक्षा में, microslide प्रसार परख एक प्रारंभिक स्क्रीन के रूप में अपने अपेक्षाकृत उच्च संवेदनशीलता के लिए और प्रतिक्रिया पालन के अपने आसानी के लिए विकसित किया गया था। अल। Lachica एट 11 का काम है, जो में agarose ओवरले स्ताफ्य्लोकोच्चुस के तनाव से न्युक्लिअसिज़ के उत्पादन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया से संशोधित, microslide प्रसार परख रेडियल immunodiffusion विधि 14 को इसी तरह से चल रही है के रूप में प्रोटीन में अच्छी तरह से diffuses agarose सब्सट्रेट युक्त। रेडियल immunodiffuसायन पद्धति के immunoprecipitation के क्षेत्र के विस्तार रुकती है जब सिस्टम diffusing प्रतिजन और एंटीबॉडी agarose भीतर के बीच एक जटिल गठन संतुलन तक पहुँचता है। इसके विपरीत, microslide प्रसार परख के सब्सट्रेट शुरू में अच्छी तरह से आसपास के सेल की एक लगातार विस्तार क्षेत्र में diffusing प्रोटीन रोगाणुरोधी से पच जाता है। क्षेत्र की बढ़ती व्यास जारी है जब तक एंजाइम खो देता है गतिविधि या सब्सट्रेट समाप्त हो रहा है। सेल के क्षेत्र के उत्पादन की दर एंजाइम की, पवित्रता, और इस तरह विशिष्ट गतिविधि के रूप में जिलाया है या एंजाइम की एकाग्रता बढ़ जाती है अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा।
मात्रात्मक गर्मी मारे बी के खिलाफ प्रोटीन antimicrobials के enzymatic गतिविधि का आकलन करने के लिए subtilis, डाई-रिहाई परख चुना गया था। Remazol खूब ब्लू आर डाई (RBB) का उपयोग वर्णमिति assays -labeled substrates प्रोटीन रोगाणुरोधी गतिविधियों के बहुमुखी और संवेदनशील मूल्यांकन की अनुमतिTy। घुलनशील नीले उत्पादों की रिहाई है कि आसानी से 595 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से मापा जा सकता है में RBB लेबल सब्सट्रेट परिणामों के enzymatic हाइड्रोलिसिस। RBB डाई रिलीज परख के कई रूपों, अन्य प्रोटीन रोगाणुरोधी एंजाइमों को चिह्नित करने के लिए विकसित की है, अन्य substrates के साथ आवेदन के लिए इस परख का लचीलापन दिखा। उदाहरण के लिए, bacteriolytic गतिविधि lysostaphin के प्रभाव का निर्धारण करने में, झोउ, एट अल।, RBB रंगे staphylococcal कोशिकाओं और substrates 12 के रूप में staphylococcal पेप्टीडॉग्लीकैन का उपयोग कर एक डाई रिलीज परख की सूचना दी। इस RBB डाई रिलीज परख के आवेदन की एक संशोधन में, RBB लेबल Micrococcus luteus सब्सट्रेट ऐसे जीवाणु संक्रमण और एक घातक कार्सिनोमा की उपस्थिति, जैसे रोगों के लिए एक तेजी से और संवेदनशील साधन के रूप में उपयोग के निदान के लिए और स्क्रीन के लिए प्रस्तावित किया गया था जो कर सकते हैं रक्त सीरम 15 में मानव लाइसोजाइम अभिव्यक्ति के स्तर को सहसंबद्ध किया। एक इसके अलावा, RBB लेबल बैक्टीरिया कोशिका substrates हैLSO लाइसोजाइम 16 का पता लगाने के लिए एक zymogram विधि में इस्तेमाल किया गया।
हम उतारा सीमा का पता लगाने, सुविधा, और डाई रिलीज परख के reproducibility का प्रदर्शन, एंजाइम उत्पादन के लिए तेजी से पुस्तकालय स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है। परख का संशोधन तापमान, पीएच, और लवणता के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से रोगाणुरोधी प्रोटीन 6 की गतिविधि पर अन्य एंजाइमों के प्रभाव सहित नीचे की ओर मात्रात्मक जैव रासायनिक लक्षण वर्णन assays, के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, मात्रात्मक डाई रिलीज परख एक दिया सब्सट्रेट के लिए कई एंजाइमों की गतिविधियों की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। RBB डाई रिलीज परख लक्षण और प्रोटीन रोगाणुरोधी एजेंटों का पता लगाने के अलावा polysaccharides के खिलाफ गतिविधि के साथ एंजाइमों के लिए उपयोगिता की सूचना दी है। Pettersson और एरिकसन endoglycanase गतिविधि का पता लगाने अनाकार, सेल्यूलोज, xylan, मन्नान, और चिट के RBB रंगे polysaccharide मनकों का उपयोग के लिए एक परख सूचना दी17 में। इन निष्कर्षों का एक विस्तार में, काइटिनेस बेसिलस thuringiensis बीटी -107 द्वारा उत्पादित एंजाइमों का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका कोलाइडयन काइटिन RBB 18 के साथ लेबल का उपयोग कर विकसित किया गया था। इन और अन्य अध्ययनों से, RBB रंगे substrates के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों केरातिन, amylopectin, amylose, ग्लाइकोजन, laminarin, डी-xylan, azo-जौ Glucan, और स्टार्च के खिलाफ उन सहित glycolytic गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग में उभरा है।
इस अध्ययन में, हम एक microplate प्रारूप में डाई रिलीज परख की उपयोगिता का प्रदर्शन, RBB लेबल सब्सट्रेट और एंजाइम वर्णमिति परिणाम का उत्पादन करने की आवश्यकता की मात्रा को कम करने। जैसा कि चित्र 4 और 5 चित्रा में सचित्र, microplate डाई रिलीज परख enzymatic गतिविधि का पता लगाने के लिए microslide प्रसार परख की तुलना में कम सीमा का पता लगाने प्रदान करता है। व्याख्या का तेजी से उपयोग के संबंध में, श्रम के संरक्षण, और आसानी के साथ, Microslide प्रसार परख रोगाणुरोधी गतिविधि की उपस्थिति के साथ ही नीचे की ओर प्रोटीन अलगाव और शुद्धि चरणों में रोगाणुरोधी प्रोटीन उपस्थिति के संकेत के लिए प्रारंभिक उच्च throughput स्क्रीन में उपयोगिता प्रदान करता है। इन दो assays के संयोजन प्रारंभिक जांच और उपन्यास प्रोटीन antimicrobials का परम लक्षण वर्णन में एक दूसरे के पूरक
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The MITRE Corporation through the MITRE Innovation Program (Project 25MSR621-CA). The authors would like to thank Mark Maybury, Ph.D., Richard Games, Ph.D., James Patton, Ellen Mac Garrigle, Ph.D., Carl Picconatto, Ph.D., and Caroline Gary for their support and review of this work.
Materials
| 48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid | Becton Dickinson | 3078 | |
| 96-well flat-bottom microplate (Costar 3595) | Corning, Inc. | 3595 | |
| agarose | Fisher Scientific | BP162-100 | |
| α-chymotrypsin | MP Biomedicals | 215227205 | |
| Bacillus subtilis 168 | American Type Culture Collection | 23857 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| cork borer | Humboldt | H-9661 | |
| lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| McFarland equivalence standard (2.0) | Fisher Scientific | R20412 | |
| microslides | Fisher Scientific | 22-38-103 | |
| nutrient broth | Fisher Scientific | S25959B | |
| peptidoglycan of Bacillus subtilis 168 | Sigma-Aldrich | 69554-10MG-F | |
| phosphate-buffered saline (1×) | Teknova | P0200 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Life Technologies | 23227 | |
| Synergy HT microplate spectrophotometer | BioTek Instruments, Inc. | ||
| Remazol brilliant blue R dye (RBB) | Sigma-Aldrich | R8001 | |
| Salmonella enterica subsp. enterica | American Type Culture Collection | 10708 | |
| sodium azide | Fisher Scientific | S227-100 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film | Diversified Biotechnology | T-TOPS-50 | |
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solution | |||
| agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose |
Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution | ||
| nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water |
|||
| 250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water |
|||
| 200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution |
References
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