Kvalitativa och kvantitativa analyser för att upptäcka och karakterisering av protein Antimicrobials

Summary

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Abstract

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Introduction

Antimicrobial agents play an essential role in targeting a wide range of microorganisms such as viruses, fungi, and bacteria. The antimicrobial activities produced by various bacteria range in target specificity from broad-spectrum to species-specific, including clinically relevant bacterial pathogens ¹. In nature, protein antimicrobial compounds like bacteriocins and lysins represent a microbial arsenal of tools for self-defense, replication, and nutrient acquisition ^2,3. Serving as mediators of population dynamics within microbial communities, protein antimicrobials provide a competitive advantage to the producing organism over nonproducing, sensitive species ⁴. As recombinant enzymes and probiotics, these proteins also have an economic and societal importance as the need for new sources of pathogen control increases with each new expansion of antimicrobial resistance within the bacterial population ⁵.

The first evaluations of newly discovered protein antimicrobials include determining the basic physical characteristics that are inherent to the enzyme. Methods for rapid screening of potential antimicrobials allow selection of candidates with hydrolytic activities against the desired target substrates. The microslide diffusion assay and the quantitative dye-release assay allow for the use of a variety of substrates in the detection of enzymatic hydrolysis. For protein antimicrobial enzymes with activity against the bacterial cell wall, the versatility of these assays allow rapid and effective, qualitative and quantitative screening against viable bacterial cells (microslide assay only), heat-killed whole bacterial cell substrates, or purified peptidoglycan from the target bacterium. These assays have utility in antimicrobial enzyme discovery for use in fields such as alternative therapeutics, food supplements, and inhibitors of biofilm production.

The microslide diffusion assay and the dye-release assay are demonstrated methods for detection and characterization of novel protein antimicrobials. The microslide diffusion assay provides a relative (qualitative) estimate of antimicrobial activity and allows for minimal inference of enzyme concentration and activity. Using this method, activity is readily visualized as the development of a zone of lysis with the absence of activity resulting in a lack of zone formation. The rate of zone development and the zone diameter are indicative of the amount and purity of the enzyme present in the sample; however, this rate and the quality of the substrate clearing within the zone can also be affected by the presence of contaminants, the completeness of the hydrolysis reaction, and the type of substrate. Interfering contaminants can affect the rate of enzyme diffusion from the well, while incomplete hydrolysis or variation of the substrate type can result in a turbid zone of lysis ⁶.

The dye-release assay quantitatively assesses the amount of covalently-linked Remazol brilliant blue R dye products released into the reaction supernatant from the enzymatically hydrolyzed substrate. The method has only slight variability associated with a difference in substrate, thus allowing greater sensitivity for detection of hydrolysis as compared to the microslide diffusion assay. These properties allow the method to have utility in the characterization of biochemical properties of the enzyme and in the standardization of the assay for comparison between different antimicrobial enzymes.

In this protocol, we provide methods to perform the basic microslide diffusion assay and dye-release assay, while demonstrating the scale of detection limits and variability for each. The assays are used to perform basic evaluations of an unknown protein antimicrobial purified from the culture supernatant of an uncharacterized soil bacterial isolate. Observed activities against bacterial cell substrates within the assays allow comparison of reaction activities between a previously uncharacterized protein antimicrobial and α-chymotrypsin, a control proteolytic enzymes. These protocols provide a foundation for the application of the two techniques that can be expanded and modified to accommodate varied applications.

Protocol

1. Framställning av bakteriell och peptidoglykan substrat Obs: Hela cell bakteriella substrat och renade peptidoglykaner används som enzymsubstrat i både Micro diffusion analysen och färgämnet-frisättningsanalys. Dessa substrat kräver förberedelser innan de genomför enzymreaktioner. Följande protokoll beskriver deras framställning. Hela Bakteriell cellsubstrat Producera bakteriecellsubstrat genom inokulering 500 ml näringsbuljong med en 2 ml övernattskultur av Bacillus subtilis 168 (American Type Culture CoUection, ATCC 23857). Inkubera vid 30 ° C med skakning (125 rpm) tills kulturen når en exponentiell tillväxtfas, definieras som en snabb tillväxt fas vilket resulterar i en fördubbling av bakteriekulturen. För odling av Salmonella enterica subsp. Enterica (ATCC 10708), använd näringsbuljong som ett tillväxtmedium vid 37 ° C med skakning (125 rpm). </li> Värme döda varje kultur genom autoklavering under 10 min vid 121 ° C under 3 atm tryck. Skörda värmeavdödade bakteriella substrat genom centrifugering under 20 min vid 5000 x g. Tvätta pelleten tre gånger med typ 1 vatten och återsuspendera i en minimal mängd vatten. I denna studie, suspendera substraten i 1200 pl. Alikvot 300 ul av de bakteriella cellsubstrat till 1,5 ml mikrofugrör och förvara vid 20 ° C. Renad peptidoglykan Substrat Rena peptidoglykan från målsubstratet bakterien 7-10 eller förvärva från en leverantör (se Material och utrustning tabell). Rena rå peptidoglykan preparat från tillbehörscellväggspolymerer. 2. Kvalitativ Micro Diffusion analys [Modifierad från Lachica, et al. 11] Obs! Micro diffusion analysen ären kvalitativ metod för detektering av närvaron av antimikrobiella enzym i ett prov. Som enzym diffunderar genom en agaros matris innehållande substrat, en zon av clearing utvecklas som enzym hydrolyserar substratet. Följande protokoll beskriver framställningen och prestanda mikros diffusion analys för kvalitativt detektera närvaron av proteinantimikrobiella medel. Bestämma koncentrationen av den antimikrobiella enzym som skall utvärderas med hjälp av en bicinkoninsyra (BCA) Protein Assay Kit enligt tillverkarens protokoll. Utnyttja fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som en enzymbuffert; dock empiriskt bestämma den buffert lämplig för det givna enzymet. Utföra en serieutspädning av den antimikrobiella enzym med användning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som en reaktionsbuffert. Serie utspädning används i dessa Microslide diffusionsanalyser producerade slutliga analysproteinmassorna 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ng, och en0 | j, g per reaktionsvolym. Fördela proteinmassor i enskilda mikrofugrör och justera proteinvolymer till 20 ^ med användning av PBS som förberedelse för tillsättning till Microreaktionsbrunnar. Göra en 0,5% agaros-lösning genom att lösa 0,25 g av agaros i 50 ml PBS. Värm lösningen till en koka tills agarosen är fullständigt upplöst. Bestämma vattenförlusten under smältningsprocessen i vikt och lägga tillbaka till lösningen. Tillsätt 50 pl av 10% natriumazid i vatten till agaroslösningen och justera temperaturen hos lösningen till 50 ° C i ett vattenbad. Den natriumazid tillsätts för att förhindra kontaminebakterietillväxt under inkubation av mikros diffusion analysen. Om det finns praktiskt celler används som substrat, utelämna natriumazid från agarosen lösning. Tina värmeavdödade bakteriella substrat på is. Återsuspendera den bakteriella substrat i 12 ml av agaroslösningen till approximativt matcha grumlighet av en 2,0 MCFArland likvärdighet standard (se Material tabell). Jämföra turbiditet av lösningarna genom att visualisera en svart linje på en vit bakgrund genom de lösningar, lägga till bakteriell substrat till agarosen tills den ungefärliga grumlighet uppnås. Omedelbart pipettera 3 ml av agaros-substratlösning till varje mikros (25 x 75 x 1 mm 3). Efter diabilder stelna, punsch tre brunnar i agarosen-substratskikt av varje Micro med hjälp av en korkborr (4,8 mm diameter). Tillsätt 20 | il av varje justerad protein serieutspädning till sina respektive brunnar. Använda PBS (20 | il) eller bovint serumalbumin (5 ^ g i 20 ^ il PBS) i en negativ kontrollbrunn. Använda kända bakteriolytiska enzymer lämpliga för substratet, såsom lysozym, som en positiv kontroll. Inkubera objektglaset i en fuktkammare vid 37 ° C eller den optimala aktiviteten temperaturen för enzymet. Längden av inkubation beror på koncentrationen ochspecifik aktivitet av den antimikrobiella enzym. En typisk reaktionstid är över natten (ca 16 h). Efter inkubation, observera bilderna under indirekt ljus och ta bilder i utvecklingsanalys med användning av en digital spegelreflexkamera med en 60 mm objektiv på ett avstånd på ca 30 cm. Obs: Enzymatisk aktivitet av proteinet antimikrobiell för givet substrat är korrelerad med utvecklingen av en klar zon av hydrolys, som bildar runt brunnen som enzym diffunderar in i agaros. För att kvalificera den enzymatiska aktiviteten, observera storleken på zoner som bildas runt varje brunn. Hög enzymatisk aktivitet avser kvalitativt till en större zon, medan låg enzymatisk aktivitet avser kvalitativt till en mindre zon. 3. Underlag Märkning – Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling [Modifierad från Zhou 12] Obs: I färgfrisättningsanalys, är substratet kovalent linked att Remazol brilliant blue R färgämne. Följande protokoll beskriver framställningen av färgade enzymsubstrat. Gör en 250 mM natrium-hydroxid (NaOH) -lösning genom upplösning av 1 g NaOH i 99 ml typ I vatten som skall användas för framställning av en 200 mM Remazol brilliant blue R färgämne (RBB) lösning. Gör en 200 mM RBB lösning genom upplösning av 1,25 g RBB i 98,75 ml ± 1 ml av en färsk 250 mM NaOH-lösning (steg 3,1). Återsuspendera värmeavdödade bakterieceller i en koncentration av 0,5 g våt vikt i 30 ml RBB-lösning. För renad peptidoglykan, återsuspendera peptidoglykanet i en koncentration av 0,3 g våt vikt i 30 ml RBB-lösning. Inkubera reaktionsblandningen i en Erlenmeyer-kolv på en roterande plattform under 6 h vid 37 ° C med försiktig blandning. Överför reaktionsblandningen till en 4 ° C inkubator, och inkubera under ytterligare 12 h med försiktig blandning. Efter inkubation, skörda det färgade substratet genom centrifugering vid 3000 xgunder 30 min. Dekantera den färgämneslösning från substrat pelleten. Avlägsna icke-kovalent lösligt färgämne från substraten genom att tvätta färgämnesmärkta celler eller peptidoglykan upprepade gånger (ca 3-5 tvättar) med typ I-vatten följt av centrifugering. Med varje vattentillsats, återsuspendera pelleten noggrant. Obs: När obundet, lösligt färgämne inte längre syns i tvättvattnet efter centrifugering. Substratet bör ges en ytterligare tvättning. Notera att substratet kommer att förbli blå, medan den överstående lösningen av den sista tvättningen kommer att bli tydliga. Lagra deras färgade substraten suspenderade i en minimal mängd vatten vid -20 ° C för senare användning. 4. Kvantitativ Dye-frisättningsanalys Obs: Under färgfrisättningsanalys, hydrolys av RBB-färgat substrat i den enzymatiska reaktionen släpper färgade produkter i reaktionsvätskan. Kolorimetrisk mätning av mängden färgämne släpptes indikerar amount av enzymatisk aktivitet närvarande i provet för ett givet enzym. Den kvantitativa metoden möjliggör jämförelse av olika enzymer över substrat och möjliggör variation av miljöförhållanden som påverkar den enzymatiska reaktionen (t.ex. temperatur, salthalt och pH). Följande protokoll beskriver framställningen och prestanda färgfrisättningsanalys för att kvantitativt detektera den enzymatiska aktiviteten av proteinantimikrobiella medel. Förberedelser inför Dye-release analys Tillåta den frusna färgade substratet för att återgå till rumstemperatur och tvätta två gånger med analysbuffert (PBS), som empiriskt bestäms för givet enzym. Beräkna volymen av substrat suspension som behövs genom att multiplicera 200 | il reaktionsvolym med antalet färgämnesfrisättningsanalyser som skall utföras. Förbereda substratet suspensionen genom tillsats av färgade substrat till volymen av analysbuffert, bestämd i 4.1.2, tills en optisk densitet (OD) av 2,0 uppnås vid 595 nm med användning av en spektrofotometer. Att hålla sig inom de funktionella begränsningar av spektrofotometer mäter 2,0 OD 595 som 1,0 för en 1: 1 utspädning av den koncentrerade lösningen. Använd analysbuffert som en blank. Obs: Underlaget grumlighet för reaktionen kan höjas mer än 2,0 för att matcha aktivitetsnivåer av högeffektiva enzymer. Suspendera det protein antimikrobiell som skall utvärderas i analysbuffert vid en uppskattad koncentration av 1 mg / ml. Med användning av mikroplattanalys av en BCA Protein Assay Kit enligt tillverkarens protokoll, bestämma den verkliga koncentrationen av proteinprovet som skall analyseras. Justera koncentrationen av mäldsuspensionen till 1 mg / ml med användning av analysbuffert. Använda Dye-release analys för att bestämma den optimala inkubationstiden förhållanden för ett protein Antimicrobial Späd stam proteinet antimikrobiell suspensionen till 100 ng / | il. Denna koncentration ger afInal reaktionsmassan av en | j, g protein per volym (10 | il) sättes till testreaktionen. Bestäm värmeområde som skall bedömas för bakteriolytiska proteinet. Den termiska intervall i dessa analyser inkluderade 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C, och 65 ° C. Utför reaktionsanalyser i 0,5 ml mikrofugrör. För varje värmeförhållanden, tillsätt 10 pl av beståndet proteinet till 200 pl förberedda underlaget suspension. Inkubera i en termocykler för 8 timmar med blandning genom inversion en gång i timmen. Efter inkubation, gripa reaktionerna genom att tillsätta 25 pl etanol. Ta bort osmält, olösligt substrat genom centrifugering vid 3000 x g under 2 minuter, och överföra 150 ul av reaktionsvätskan för varje reaktionsblandningen till en 96-brunnars flatbottnad mikro, noga med att inte störa pelleten av osmält substrat. Mäta enzymatisk aktivitet hos proteinet Antimicrobdar e för givet substrat genom att bestämma mängden av löslig RBB färgämne dissocieras från substratet efter enzymatisk hydrolys. För att kvantifiera den enzymatiska aktiviteten, mät absorbansen av supematanten vid 595 nm med användning av en mikroplatt spektrofotometer. Ökad absorbans av det lösliga färgämnet frisätts i supernatanten från det märkta substratet är ett kvantitativt mått på enzymatisk aktivitet. Notera: Förändringen i absorbans representeras av aktivitetsenheter (AU), där 1 AU resulterar i en ökning 0,01 i den optiska densiteten hos färgämnet frisättning reaktions supernatanten vid 595 nm. En blank reaktion, inkuberades med alla reaktionskomponenter förutom enzym, används för att subtrahera varje färgämne som frigör från RBB-märkta substratet på grund av inkubationen. Den optimala enzymatiska temperatur ger toppaktivitetsenhet mätning. Upprepa steg 4.2.1 till 4.2.7 med användning av olika inkubationsbuffertar, att bestämma den optimala buffertbetingelser för den antimikrobiella enzymet. i tessa assays, använda PBS. Med användning av Dye-release analys för att bestämma den minimala aktiva koncentrationen vid den optimala inkubationstemperaturen för ett protein Antimikrobiell Utföra en seriespädning av stammen antimikrobiellt protein suspension med användning av analysbuffert. Utspädnings Serien kommer att variera med aktiviteten av den antimikrobiella enzymet. Serie utspädning som användes i dessa analyser producerade slutliga analysproteinmängder av 0 pg, 10 pg, 100 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, 1 ng och 10 mikrogram. Utför varje reaktion analys i en 48 brunnar flatbottnad mikro. För varje analys tillstånd, tillsätt 10 pl av respektive protein suspensionen till 200 pl förberedda underlaget suspension. Justera varje variation i volym av proteinlösningen sattes till reaktions till 10 ^ il med hjälp av reaktionsbuffert. Täta mikro med platta tätningsfilm för att undvika volymvariation på grund av avdunstning. Inkubera i en skakinkubator vid den fastställda optimala icubation temperatur för givet protein antimikrobiell under 16 timmar med skakning. Efter inkubation hejda reaktionen genom tillsats av 25 | il av etanol till varje brunn och avlägsna osmält substrat genom centrifugering vid 3000 x g under 2 min. Överför 150 ul av reaktionsvätskan för varje reaktionsblandningen till en 96-brunnars flatbottnad mikro, noga med att inte störa pelleten av osmält substrat. För att kvantifiera den enzymatiska aktiviteten, mät absorbansen av supematanten vid 595 nm med användning av en mikroplatt spektrofotometer. En blank reaktion, inkuberades med alla reaktionskomponenter förutom enzym, används för att subtrahera varje färgämne som frigör från RBB-märkta substratet på grund av inkubationen. Ökad absorbans av det lösliga färgämnet frisätts i supernatanten från det märkta substratet ger ett kvantitativt mått på enzymatisk aktivitet. Notera: Förändringen i absorbans representeras av aktivitetsenheter (AU), där 1 AU resulterar ien ökning 0,01 i den optiska densiteten hos färgämnet frisättning reaktions supernatanten vid 595 nm.

Representative Results

Den Micro diffusion analys och kvantitativ analys färg frisättning är effektiva metoder för screening och mätning av inledande undersökningar av nya proteinantimikrobiella medel. Varje analys har sina fördelar och begränsningar; Men, när de utförs i samband, de tillåter snabb initial screening och grundläggande karakterisering av en antimikrobiell. Den Micro diffusion analysen möjliggör effektivt för snabb screening av mikrobiella bibliotek, som producerar proteinantimikrobiella medel. När enzymkoncentrationsnivåer de är av intresse, kan känslighet begränsningar detektionsgräns analysen, vilket kräver en större mängd enzym som skall tillsättas till reaktionen väl än dye-frisättningsanalys. Som visas i figur 1, de kvalitativa egenskaperna hos analysen tillåter observatören att jämföra relativa enzym mängderna inom varje brunn. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> i framkallningszonen av lys, som illustreras i figur 1 A (25 | j, g enzym), den främre kanten av zonen visar grumliga eller ofullständig lys av substratet, under det att zonen närmast brunnen visar en mer komplett underlag lys. Detta fenomen, en produkt av den minskande koncentrationen av den diffunderande enzymet vid den främre kanten, komplicerar noggrann mätning av zonen diameter. När Wells B (15 mikrogram), C (10 mikrogram), D (5 mikrogram), E (1,0 mikrogram), och F (0,1 mikrogram) observeras i figur 1, diametern på zonen för fullständig lys försvinner till utrotning korrelera till den minskade mängden av enzym. För tillstånds F (0,1 ^ g), är enzymkoncentrationen inuti agarosen under gränsen som kommer att tillåta det diffunderande enzym som skall visualiseras som den rör sig genom agaros, hydrolysera substratet. Den Micro diffusion analysen kördes också med användning av renade Bacillus subtilis peptidoglycan som substrat (Figur 2). Medan zonen är mindre definierad än de som observerats med hela cell Salmonella enterica på grund av ovilja av peptidoglykan att jämnt suspendera i agaros, är hydrolysen av peptidoglykan genom det okända antimikrobiella enzym uppenbar. Analysfärg utgåvan är en känsligare och mer mångsidig analys än mikros diffusion analysen, vilket gör att en lägre detektionsgräns och variation av miljöfaktorer som påverkar enzymreaktionen. I de representativa analyserna, var temperaturen varieras för att bestämma den optimala temperaturen för den antimikrobiella enzym, bestämdes vara 35 ° C i PBS (Figur 3). Detta optimum ses tydligt i reaktions supernatanterna som ökade mängder av blå färg (figur 3B) liksom representerade i aktivitetsenheter härledda från absorbansmätningar vid 595 nm (figur 3A). Demångsidighet av färgämnet-frisättningsanalysen tillåter forskaren att variera inte bara de temperaturer men även reaktionsbufferten och buffertkomponenter för att snabbt bestämma optimala inkubationsbetingelser för ett givet enzym. Aktivitetsnivån för det okända antimikrobiella enzym (Figur 4) och α-chymotrypsin kontroll enzym (Figur 5) mättes vid den fastställda optimala inkubationstemperaturen på 35 ° C i PBS mot RBB-märkt Bacillus subtilis värmeavdödade substrat. Jämförelse av resultat från figur 4 och figur 5 visar att det okända antimikrobiella enzymet har nästan dubbelt så affinitet för B. subtilis substrat. Dessutom gjorde α-chymotrypsin kontroll inte helt smälta värme dödade B. subtilis substrat inuti brunnen (data ej visade). Aktiviteten hos α-chymotrypsin kontroll börjar plattanau cirka 0,3 mikrogram jämfört med fortsatt stigande aktivitetsenheter i alla enzymbelopp för det okända antimikrobiella enzym (Figur 4 och Figur 5). Detta kan indikera att det okända enzymet har en större bibehållen aktivitet eller att det finns ett större antal klyvningsställen tillgängliga för enzymet inom B. subtilis substrat. Figur 1:. Enzymaktivitet mot Salmonella enterica helcell substratet Micro diffusion analys användes för att kvalitativt utvärdera aktiviteten hos ett okänt protein antimikrobiell mot värmedödade Salmonella enterica subsp enterica (ATCC 10708).. Protein massorna av den okända antimikrobiella suspenderades i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som tillsattes till respektive brunnar ibilderna ingår 25 mikrogram (brunn A), 15 mikrogram (väl B), 10 mikrogram (väl C), 5 mikrogram (väl D), ett mikrogram (väl E), och 0,1 ng (brunn F). PBS enbart användes för de negativa kontrollerna från analyserna. Zoner lys avbildades efter en sex timmars inkubation. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2:. Enzymaktivitet mot Bacillus subtilis peptidoglykan cellvägg Den Micro diffusion analys användes för att kvalitativt utvärdera aktiviteten hos ett okänt protein antimikrobiell mot peptidoglykan av Bacillus subtilis 168. Suspenderades i 20 | il PBS, 10 ^ g av den okända antimikrobiella sattes till brunn A i microslides. PBS enbart användes som en negativkontroll för analysen (väl B). Zonen av lys avbildades efter en sex timmars inkubation vid 37 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3:. Optimala reaktionstemperaturen för en protein Antimicrobial Mångsidigheten hos färgämnet-frisättningsanalysen tillåter variation av fysikaliska och kemiska parametrar, såsom inkubationstemperaturer och buffertar, för att fastställa deras påverkan på aktiviteten av enzymet av intresse 6. Såsom illustreras i denna figur, var aktiviteten av det okända proteinet antimikrobiell (1 ^ g) utvärderades i PBS mot RBB-märkta värmeavdödade Bacillus subtilis enligt en rad olika inkubationstemperaturer. Visas som aktivitetsenheter (AU) i (A), absorbans RBB-bound produkter släpps ut i supernatanten efter hydrolys mättes vid 595 nm med hjälp av en mikro spektrofotometer. Vid varje temperaturtillstånd, var reaktioner utan tillsatt enzym används för att subtrahera effekterna av släppt färgämne som resulterade från inkubation vid olika temperaturer. Reaktions supernatanterna motsvarar varje inkubationstemperaturen avbildades före absorbansmätning (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4:. Aktivitetsintervall för ett protein Antimikrobiell Aktiviteten intervallet för det okända proteinet antimikrobiell mättes som aktivitetsenheter efter över natten inkubationer för 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, och 1000 ng , mätt med BCA-protein-analys (A). För dessa reaktioner, RBB-märkta B. subtilis substratnivån ökades för att ge en optisk densitet av 5,0 vid 595 nm för att säkerställa att reaktionen med det högsta beloppet av enzym (1000 ng) inte helt hade hydrolyse alla tillgängliga substrat i reaktions inkubationstiden. Kontrollreaktioner utan enzym användes för att subtrahera effekterna av utsläppt färgämne som orsakas av inkubation ensam. Reaktions supernatanterna motsvarar varje enzym belopp avbildades före absorbansmätningar (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5:. Aktivitetsintervall för α-chymotrypsin Aktivitetsområdet för α-chymotrypsin mättes som activity enheter efter över natten inkubationer för 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, och 1000 ng enzym (A). För dessa reaktioner, RBB-märkta B. subtilis substratnivån ökades för att ge en optisk densitet av 5,0 vid 595 nm för att säkerställa att reaktionen med det högsta beloppet av enzym (1000 ng) inte helt hade hydrolyse alla tillgängliga substrat i reaktions inkubationstiden. Kontrollreaktioner utan enzym användes för att subtrahera effekterna av utsläppt färgämne som orsakas av inkubation ensam. Reaktions supernatanterna motsvarar varje enzym belopp avbildades före absorbansmätningar (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den Micro diffusion analysen och färgfrisättningsanalysen ger fördelar för att detektera och karakterisera tidigare oidentifierade proteinantimikrobiella medel. Dessa snabba och känsliga metoder medger high-throughput screening av organismer källbibliotek för identifiering av enzymer av intresse innan investera större forskningsresurser. Som hög profil målenzym har identifierats, kan variationer av detektionsanalyser användas för att snabbt detektera enzymet eller för att bestämma biokemiska egenskaper hos enzymet. Till exempel, under en flerstegsproteinreningsschema, den mikros diffusionsanalys kan snabbt detektera fraktioner innehållande enzymet av intresse. Dessutom kan reaktions optima för enzymet bestämmas genom att förändra reaktionsbuffertar och inkubationstemperaturer i färgämnet-frisättningsanalys.

Intervallet av enzym massa som krävs för detektering i mikros diffusionsanalys är en funktion av enzymkänneSTICS. Detekterings begränsningar av analysen kräver i allmänhet användning av högre mängder enzym än dye-frisättningsanalys. I denna studie, jämförelse av gränserna för mikros diffusion analysen (Figur 1) till färgfrisättningsanalys (Figur 4) detektions illustrerade att mikros diffusion analysen är mindre känslig teknik än dye-frisättningsanalys. När enzymkoncentrationen är inte ett problem, medger mikros analys för snabb initial screening av bibliotek för framställning av proteinantimikrobiella medel mot mål substrat med låga krav arbetskraft och utrustning. Även kräver mer ansträngning och utrustning, är färgfrisättningsanalysen mer känslig och reproducerbar, vilket ger kvantitativa resultat som tillåter jämförelse mellan färgfrisättningsanalyser av samma eller olika enzymer för ett givet substrat. De två metoderna är lätt utföras i de flesta mikrobiologiska laboratorier utan behov av högt specialiserad instrumentering. I representiva analyser, kontrollenzym, α-chymotrypsin, detekterades vid mängder som är så låga som 100 ng (Figur 5) med användning av det färgämnesfrisättningsanalys, under det att minimal mängd detekteras i mikros diffusion analysen var 1 pg (data ej visade).

Tillhandahålla verktyg som en kvalitativ analys av antimikrobiella enzymer upptäckt, har ett antal varianter av diffusion analysen rapporterats ^11,13. Vid granskningen dessa analyser, var mikros diffusion analys utvecklad för sin relativt hög känslighet som en inledande undersökning och för dess enkla reaktions efterlevnad. Modifierad från arbetet av al. Lachica et ^11, i vilken agaros överlägg användes för att detektera produktionen av nukleaser av stammar av Staphylococcus aureus, driver mikros diffusionsanalys på liknande sätt som den radiella immundiffusion metoden ¹⁴ som proteinet diffunderar från brunnen in i agaros innehållande substratet. Den radiella immunodiffusionen metod stoppar expansionen av det fria immunoprecipitation när systemet når en komplexbildning jämvikt mellan det diffunderande antigen och antikropp inom agarosen. I motsats, är substratet av mikros diffusionsanalys initialt ned av diffunderande proteinantimikrobiella i en ständigt expanderande zon av lys omgivande brunnen. Den ökande diameter zonen fortsätter tills enzymet förlorar aktivitet eller underlaget är uttömd. Hastigheten för produktion av den zon av lys levande som renheten, och därmed den specifika aktiviteten, hos enzymet eller koncentrationen av enzymet till brunnen ökar.

För att kvantitativt utvärdera den enzymatiska aktiviteten av proteinantimikrobiella medel mot värme-dödade B. subtilis, var färgämnet-frisättningsanalys valt. Kolorimetriska analyser som använder Remazol brilliant blue R färgämne (RBB) -märkta substrat tillåter mångsidiga och känslig utvärdering av protein antimikrobiell activity. Enzymatisk hydrolys av RBB-märkt substrat resulterar i frisättning av lösliga blå produkter som enkelt kan mätas genom en spektrofotometer vid 595 nm. Flera varianter av RBB färgfrisättningsanalys, har utvecklats för att karakterisera andra proteinantimikrobiella enzymer, visar flexibiliteten i denna analys för tillämpning med andra substrat. Till exempel i att bedöma effekterna av lysostafin bakteriolytiskt aktivitet, Zhou et al., Rapporterade en färgfrisättningsanalys med användning av RBB-färgade stafylokocker celler och stafylokocker peptidoglykan som substrat ^12. I en modifiering av tillämpningen av denna RBB färgämne-frisättningsanalys, var RBB-märkt Micrococcus luteus substrat föreslagits för användning som ett snabbt och känsligt medel för att diagnostisera och skärm för sjukdomar såsom bakteriell infektion och närvaron av ett malignt karcinom, vilket kan korreleras till humana lysozym-expressionsnivåer i blodserum ^15. Dessutom, RBB-märkta bakteriecellsubstrat har enLSO använts i ett zymogram metod för detektion av lysozym ^16.

Vi visar den sänkta detektionsgränsen, bekvämlighet och reproducerbarhet av färgämnet-frisättningsanalys, vilket möjliggör snabba biblioteksscreening för enzymproduktion. Ändringar av analysen möjliggör nedströms kvantitativa biokemiska karakterisering analyser, inklusive effekter av temperatur, pH och salthalt samt effekterna av andra proteolytiska enzymer på aktiviteten av antimikrobiella proteiner ^6. Dessutom kan den kvantitativa analysen färg frisättning användas för att jämföra verksamheten i flera enzymer för ett givet substrat. RBB färgfrisättningsanalys har rapporterat användbarhet för enzymer med aktivitet mot polysackarider förutom karakterisering och detektion av proteinantimikrobiella medel. Pettersson och Eriksson rapporterade en analys för att detektera endoglykanas aktivitet med användning av amorfa, RBB-färgade polysackarid pärlor av cellulosa, xylan, mannan och chiti ^17. I en utvidgning av dessa fynd var en känslig metod för detektion av kitinas enzymer som produceras av Bacillus thuringiensis Bt-107 utvecklas med hjälp av kolloidalt kitin märkt med RBB ^18. Från dessa och andra studier, har kommersiellt tillgängliga källor av RBB-färgade substrat framkommit för användning vid detektion av glykolytiska aktivitet, inklusive de mot keratin, amylopektin, amylos, glykogen, laminarin, d-xylan, Azo-korn glukan, och stärkelse.

I denna studie visar vi nyttan av färgämnet-frisättningsanalys i en mikroplattformat, att minska volymen av RBB-märkt substrat och enzym som erfordras för att producera den kolorimetriska resultatet. Såsom illustreras i figur 4 och figur 5, ger mikroplattan dye-frisättningsanalys en lägre detekteringsgräns än den mikros diffusionsanalys för enzymatisk aktivitet detektering. När det gäller snabb användning, bevarande av arbetskraft, och enkel tolkning, microslide diffusion analys ger nytta i första hög genomströmning skärmar för närvaron av antimikrobiella aktiviteten liksom indikation på antimikrobiellt protein närvaro i nedströms protein isolerings- och reningssteg. Kombinationen av dessa två analyser kompletterar varandra i den inledande granskningen och slutliga karakterisering av nya proteinantimikrobiella

Materials

48-well flat-bottom microplate with low evaporation lid	Becton Dickinson	3078
96-well flat-bottom microplate (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
agarose	Fisher Scientific	BP162-100
α-chymotrypsin	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
cork borer	Humboldt	H-9661
lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876-1G
McFarland equivalence standard (2.0)	Fisher Scientific	R20412
microslides	Fisher Scientific	22-38-103
nutrient broth	Fisher Scientific	S25959B
peptidoglycan of Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
phosphate-buffered saline (1×)	Teknova	P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit	Life Technologies	23227
Synergy HT microplate spectrophotometer	BioTek Instruments, Inc.
Remazol brilliant blue R dye (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
sodium azide	Fisher Scientific	S227-100
sodium hydroxide (NaOH)	Fisher Scientific	S318-500
Titer Tops pre-cut adhesive polyethylene film	Diversified Biotechnology	T-TOPS-50
UltraPure distilled water	Invitrogen	10977-015
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solution
agarose solution 50 ml PBS 0.25 g agarose			Add 10% sodium azide to the molten PBS/agarose solution
nutrient broth medium 4 g nutrient broth 500 ml Type I water
250mM sodium hydroxide (NaOH) solution 1 g NaOH 99 ml Type I water
200mM Remazol brilliant blue R dye (RBB) 1.25 g RBB 98.75 ml 250 mM NaOH solution