This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.
De enterisk nervesystem (ENS) spiller en viktig rolle i regulering av gastrointestinal (GI) motilitet og kan fungere uavhengig av det sentrale nervesystemet. Endringer i ENS funksjon er en viktig årsak til GI symptomer og sykdom, og kan bidra til å GI symptomer rapportert i nevropsykiatriske lidelser, inkludert autisme. Det er godt etablert at isolerte kolon segmenter generere spontane, rytmiske sammentrekninger kjent som colonic Migrere Motor komplekser (CMMCs). En fremgangsmåte for å analysere den enteriske nevrale regulering av CMMCs i ex vivo preparater av mus kolon, er beskrevet. Tykktarmen er dissekert fra dyret og spylt for å fjerne avføring innhold før den ble innført en kanyle i et organbad. Data samles inn via et videokamera plassert over organbadet og konvertert til høy oppløsning i tid og rom kartene via en in-house programvarepakken. Ved hjelp av denne teknikken, baseline kontraktile mønstre og farmakologiske effekter på ENS funksjon i tykktarmen segments kan sammenlignes over 3-4 timer. I tillegg kan forplantning lengde og hastighet CMMCs registreres samt endringer i tarmen diameter og sammentrekning frekvens. Denne teknikken er nyttig for karakterisering av gastrointestinal motilitet mønstre i transgene musemodeller (og i andre arter, inkludert rotte og marsvin). På denne måte blir farmakologisk induserte endringer i CMMCs registrert i villtype mus og i den Neuroligin-3 R451C musemodell for autisme. Videre kan denne teknikk anvendes på andre områder av mage-tarmkanalen inkludert duodenum, jejunum og ileum, og ved ulike utviklings aldre i mus.
De enterisk nervesystem (ENS) er den iboende neuronal nettverk av mage-tarmkanalen og modulerer forskjellige funksjoner slik som fordøyelse av tarminnhold, absorpsjon av næringsstoffer og sekresjon og reabsorpsjon av væske. Nerveceller i ENS er lokalisert i myentericus og submukøse plexuses. Den myentericus plexus spiller en viktig rolle i å regulere gastrointestinal motilitet en mens submucosal plexus er primært involvert i kontrollen av sekresjon 2,3. Den plexus myentericus ligger mellom de langsgående og sirkulære muskel lag av tarmveggen. Den kontraktile aktivitet av de glatte muskellagene av tarmveggen forenkler de primære funksjonene til mage-tarmkanalen ved å blande og driver tarminnhold langs lengden av tarmen 3. Selv om den ytre nerve tilførsel til mage-tarmkanalen fra CNS bidrar til gastrointestinal funksjon in vivo, Er det ENS stand til å regulere gastrointestinal funksjon uavhengig av hverandre. Denne unike egenskap gjør at den funksjonelle undersøkelse av tarm nevrale kretser og deres bidrag til gastrointestinal motilitet ex vivo.
Colonic trekkende motor komplekser (CMMCs) er spontane, nevrogene hendelser som er den dominerende motor mønsteret observert i isolerte mus kolon i fravær av ekskrementpelletene 4-9. CMMCs er definert som rytmiske kontraksjoner som forplanter seg langs en horisontal avstand som er minst halvparten av den totale lengden av tykktarmen (dvs. fra cecum til endetarmen) 10. Forholdet mellom CMMCs og kontraktile mønstre som driver ekskrementpelletene er ennå ikke klarlagt, men noen farmakologiske forskjeller har blitt rapportert 11. Ikke desto mindre evne til ENS for å fungere uavhengig av CNS og eksistensen av neural-mediert motor mønstre i standarden ISolated kolon gir en ideell analysesystem for å undersøke forstyrrelser i bevegeligheten som følge av underliggende ENS dysfunksjon. Spontanitet av gastrointestinale motoriske mønstre gjør funksjonelle endringer i respons til farmakologiske stimuli som skal evalueres.
Bruk av video bildebehandling og spatiotemporal kartlegging ble først utviklet for å kvantitativt undersøke små intestinal peristaltikk i marsvin 12. Her blir en ex vivo teknikk som er beskrevet som gjør det mulig å studere mus tykktarmsmotilitet mønstre ved hjelp av video-avbildning og analyse av disse opptakene å konstruere høy oppløsning (~ 100 mikrometer, 33 msek)-kart av colonic diameter som en funksjon av posisjon langs kolon og tid (tid og rom kart). Ved hjelp av in-house edge deteksjon programvare (Analyse2, tilgjengelig på forespørsel), er data fra full lengde colonic segmenter entreprenør i sanntid behandlet for å generere tid og rom kart for hvert forsøk. I dette trinnet, video (AVI) -filer er summahovedservice– og konvertert til tid og rom kart ved hjelp Analyse2. Tid og rom kart (figur 2) viser kontraktilitet over tid, og muliggjøre måling av flere parametere, inkludert forplantningshastighet, størrelse, lengde og varighet. Gut diameter er også registrert i løpet av varigheten av forsøket som et mål på den samlede kontraktilitet av vevet segmentet. Denne fremgangsmåten kan anvendes for å identifisere forskjeller i initieringspunkt for kontraktile komplekser som kan indikere forandrede enteriske nerve tilkobling.
En tilsvarende videoavbildningsprotokoll utviklet for å vurdere pellet fremdrift hos marsvin har blitt rapportert 13 imidlertid her vi forklarer anvendelsen av videobilled metode for kvantifisering av spontan tykktarmsmotilitet (dvs. i fravær av pellets). Vi gir også detaljert informasjon for å bistå i disseksjon og utarbeidelse av gastrointestinal vev for videobilde tilnærming. Detteprotokollen gir forskere med et tilgjengelig og lett å replikeres verktøy for å analysere enterisk neural kontroll av gastrointestinal funksjon i dyremodeller av sykdom, inkludert genetiske musemodeller.
Den videoavbildningsteknikk muliggjør analyse av tykktarmsmotilitet i respons til forskjellige farmakologiske midler. Legemidler kan administreres via tarmkanalen eller organbadet eksterne til colonic forberedelse. Forskjellige deler av mage-tarmkanalen mus utviser spesifikke motilitet mønstre slik som i tynntarmen segmentering og CMMCs i tykktarmen.
Denne teknikken har blitt anvendt for å identifisere forskjeller i strekk liten tarmfunksjonen; forskjellig sensitivitet til 5-HT3 og 5-HT-4-antagonister ble observert i jejunum fra Balb / c og C57 / BL6 mus på grunn av den polymorfe arten av tph2-genet uttrykkes i de to stammene 6. Effekten av 5-HT-inhibering på motilitet forblir controversielle, som motstridende data har blitt rapportert på betydningen av endogent 5-HT på colonic peristaltikk og CMMCs 14,15. Endringer i motilitet pre- og postnatalt under utvikling 7, og effekten av genmutasjoner på gastrointestinal motilitet i dyremodeller av sykdom 10 kan også bli undersøkt ved å benytte video bildebehandling. Her vi illustrere bruken av fremgangsmåten for et studium av tykktarmsmotilitet i NL3 R451C musemodell for autisme, som uttrykker en missense mutasjon i genet som koder for Nlgn3 synaptiske bindingsproteinet, Neuroligin-3 16. Denne mutasjonen ble først identifisert i pasienter diagnostisert med autisme spektrum lidelse (ASD) 17, som er sterkt assosiert med GI dysfunksjon 18-22. Vi undersøkte om NL3 R451C synaptiske mutasjonen påvirker nerve utganger i ENS ved å bruke videoavbildningsteknikk. Vi presenterer data som kjennetegner CMMCs ved utgangspunktet og som reaksjon på det serotonerge 5HT 3/4 reseptor antagonist tropisetron i NL3 R451C musemodell for autisme.
Ved hjelp av denne videoen avbildningsteknikk, ble CMMC frekvens målt som en indikasjon på tykktarmsmotilitet i villtype og NL3 R451C mus, en musemodell av autisme spektrum lidelse 17. Våre resultater tyder på en reduksjon i antallet CMMCs i mutante NL3 R451C-mus sammenlignet med villtype mus i nærvær av 5HT 3/4 reseptorantagonist Tropisetron hvilket antyder at NL3 R451C mus oppviser en økt følsomhet for Tropisetron. Derfor foreslår vi at neuroligin-3 R451C…
The authors have nothing to disclose.
JCB og ELH-Y ble støttet av US Department of Defense CDMRP Autism Research Program (AR11034). NHMRC (1047674) til ELH-Y.The mai Stewart Bursary-universitetet i Melbourne tillit finansiert stipend til MS. Vi takker Ali Taher, Fátima Ramalhosa og Gracia Seger for tekniske bidrag.
Reagents | |||
NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
D-Glucose anhydrous (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Two chambered organ bath Dimentions: 14 cm x 8 cm x 3 cm |
Custom Made | Contact Laboratory Directly | |
732 MULTI -PURPOSE SEALANT CLEAR | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1890573 | |
SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning Australia Pty Ltd | 1064291 | |
STOPCOCK 3 WAY FEM-ML L/LOCK S | Terumo Medical Corporation | 0912-2006 | |
SYRINGES with Luer Lock Tips 50mL, 20 mL, 10 mL | Terumo Medical Corporation | N/A | |
1.57 mm (ID) x 3.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-008 | |
1.02 mm (ID) x 2.16 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-005 | |
1.50 mm (ID) x 2.50 mm (OD) – Silastic Tubing | Masterflex | 508-007 | |
1.60 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 14 | |
4.40 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 – 15 | |
3.10 mm (ID) – Platinum cured silicone tubing | Masterflex | 96410 -16 | |
Graduated Laboratory Glass Bottles – 500 ml | Thermofisher Scientific | 100-400 | |
CHEMICAL RUBBER STOPPER 57 x 65mm | |||
CHEMICAL RUBBER STOPPER 29 x 32mm | |||
Water heater (thermo regulator) | Ratek | TH7000 | |
Logitech Webcam | Logitech | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Virtual Dub – 1.9 11 | virtualdub.org | ||
MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
Logitech Webcam Software | Logitech |