De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.
Intracellulaire opname is een krachtige techniek gebruikt om te bepalen hoe een enkele cel kan reageren op een bepaalde prikkel. In de visie van het onderzoek, is de intracellulaire opname van oudsher een veel voorkomende techniek die gebruikt wordt om de gevoeligheden van de individuele fotoreceptorcellen bestuderen om ander licht stimuli die nog vandaag wordt gebruikt geweest. Toch blijft er een gebrek aan gedetailleerde methodologie in de literatuur voor onderzoekers die willen intracellulaire opname experimenten repliceren in het oog. Hier presenteren we de insecten als model voor het onderzoeken oog fysiologie algemeen. Insect fotoreceptorcellen bevinden zich in de buurt van het oppervlak van het oog en zijn dus gemakkelijk te bereiken, en veel van die betrokken zijn bij de visie mechanismen zijn geconserveerd over dierlijke phyla. We beschrijven de basisprocedure voor in vivo intracellulaire opname van fotoreceptorcellen in het oog van een vlinder, met het doel om deze techniek toegankelijker voor onderzoekers maar weinig ervaring in electrophysiology. We introduceren de basisuitrusting die nodig is, hoe je een live-vlinder voor te bereiden voor het opnemen, hoe je een glas micro-elektrode in een enkele cel, en tenslotte de opname procedure zelf in te voegen. Ook de elementaire analyse van ruwe responsgegevens leggen voor het bepalen van de spectrale gevoeligheid van individuele celtypen. Hoewel onze protocol gericht op het vaststellen spectrale gevoeligheid, andere stimuli (bijv gepolariseerd licht) en variaties van de werkwijze van toepassing op deze opstelling.
De elektrische eigenschappen van cellen zoals neuronen worden waargenomen door het meten ionenstroom door celmembranen als een verandering in spanning of stroom. Verschillende elektrofysiologische technieken ontwikkeld om bio-elektrische gebeurtenissen in cellen te meten. Neuronen in de ogen van dieren toegankelijk zijn en de schakeling is vaak minder complex dan in de hersenen, waardoor deze cellen goede kandidaten voor elektrofysiologisch onderzoek. Voorkomende toepassingen van elektrofysiologie in het oog omvatten Electroretinografie (ERG) 1,2 en micro-elektrode intracellulaire opname. ERG betreft het plaatsen van een elektrode in of op het oog van een dier onder lichte stimulus, en meten van de verandering van de spanning als een som van de reacties van alle nabijgelegen cellen 3-6. Als men in het bijzonder geïnteresseerd in het karakteriseren van de spectrale gevoeligheid van de individuele fotoreceptorcellen, vaak meerdere celtypen tegelijk reageren op verschillende sterktes van een bepaalde prikkel; alduskan moeilijk zijn om de gevoeligheden van specifieke celtypen van ERG data bepalen vooral als er verschillende soorten spectraal vergelijkbare fotoreceptorcellen in het oog. Een mogelijke oplossing is het gebruik van transgene Drosophila te maken met de fotoreceptor (opsin) gen van belang tot uitdrukking in de meerderheid R1-6 cellen in het oog en voer ERG 7. Potentiële nadelen van deze methode zijn geen low-expressie van het fotoreceptor eiwit 8, en de lange termijn voor de productie en screening van transgene dieren. Voor de ogen met minder soorten spectraal verschillende fotoreceptoren, kan de aanpassing van het oog met gekleurde filters helpen bij het verlagen van de bijdrage van een aantal celtypen van de ERG, waardoor het toelaat schatting van de spectrale gevoeligheid maxima 9.
Intracellulaire opname is een techniek waarbij een fijne elektrode doorboort een cel en een stimulus wordt toegepast. De elektrode platen alleen dat indivrespons idual cel, zodat het opnemen van en het analyseren van meerdere afzonderlijke cellen kunnen specifieke gevoeligheden van fysiologisch verschillende celtypen 10-14 opleveren. Hoewel onze protocol richt zich op de analyse van de spectrale gevoeligheid, de basisprincipes van de intracellulaire opname met scherpe elektroden aanpasbaar voor andere toepassingen. Een andere bereiding van een monster, bijvoorbeeld, en met een scherpe kwarts elektroden kan men opnemen dieper in de optische kwab en andere hersengebieden, afhankelijk van de vraag wordt gesteld. Bijvoorbeeld responsietijden van individuele fotoreceptorcellen 15, celactiviteit in de optische lobben 16 (laminaat, medulla of lobula 17), hersenen 18 of andere ganglia 19 kunnen ook worden opgenomen met soortgelijke technieken of kleurstimuli kunnen worden vervangen door polarisatie 20 -22 of bewegende stimuli 23,24.
Fototransductie, het proces waarbij het lichtenergie wordt geabsorbeerd en omgezet in een elektrochemische signaal, is een oude eigenschap gemeen hebben bijna alle heden dier phyla 25. De visuele pigment gevonden in fotoreceptorcellen en verantwoordelijk voor het initiëren visuele fototransductie is rhodopsine. Rodopsine in alle dieren uit een opsin eiwit, een lid van de 7 transmembraan G-proteïne gekoppelde receptorfamilie een corresponderend chromofoor die is afgeleid van het netvlies of een soortgelijk molecuul 26,27. Opsin aminozuursequentie en structuur chromofoor invloed op de absorptie van rhodopsine verschillende golflengten van licht. Wanneer een foton geabsorbeerd wordt door de chromofoor rhodopsine wordt geactiveerd, het initiëren van een G-proteïne in de cel cascade die uiteindelijk leidt tot het openen van membraangebonden ionkanalen 28. In tegenstelling tot de meeste neuronen, fotoreceptorcellen ondergaan graded potentiële veranderingen die kunnen worden gemeten als relatieve verandering responsamplitude met veranderende licht stimulus. Meestal een bepaaldefotoreceptor soort uiting slechts één opsin gen (hoewel uitzonderingen bestaan 8,10,29-31). Geavanceerde kleur visie, van de soort te vinden in vele gewervelde dieren en geleedpotigen, wordt bereikt met een complexe oog van honderden of duizenden fotoreceptorcellen elke uiting van één of gelegenheid meer rhodopsine types. Visuele informatie wordt vastgelegd door vergelijking antwoorden via fotoreceptor mozaïek via complexe neurale stroomafwaartse signalering in het oog en de hersenen, wat resulteert in de waarneming van een beeld compleet met kleur en beweging.
Na meting van de respons van een ruwe fotoreceptorcel verschillende golflengten van licht via intracellulaire opname, is het mogelijk om de spectrale gevoeligheid berekenen. Deze berekening is gebaseerd op het principe van Univariance, volgens welke reactie een fotoreceptorcel is afhankelijk van het aantal fotonen absorbeert, maar niet op de specifieke eigenschappen van de fotonen absorbeert 32. Elke foton dat is Absorbed door rhodopsine Dezelfde soort reactie induceren. In de praktijk betekent dit dat een cel ruwe responsamplitude zal toenemen als gevolg van hetzij een toename van de lichtintensiteit (meer fotonen te absorberen), of een verschuiving in golflengte naar zijn piekgevoeligheid (hogere waarschijnlijkheid van rhodopsine absorberen die golflengte). We maken gebruik van dit principe in verband cellulaire reacties op bekende intensiteit en dezelfde golflengte om de reacties bij verschillende golflengten en dezelfde intensiteit maar onbekend relatieve gevoeligheid. celtypen worden vaak aangegeven door de golflengte waarbij de gevoeligheid pieken.
Hier laten we een methode voor de intracellulaire registratie en analyse van de spectrale gevoeligheid van fotoreceptoren in het oog van een vlinder, met een focus op het maken van deze methode meer toegankelijk voor de bredere onderzoeksgemeenschap. Hoewel intracellulaire opname vaak blijft in de literatuur, met name wat betreft kleurwaarneming bij insecten, hebben we gevonden that beschrijvingen van de materialen en werkwijzen zijn gewoonlijk te kort om voor reproductie van de techniek. Wij stellen deze werkwijze videoformaat met het doel van het toestaan zijn gemakkelijker replicatie. We beschrijven ook de techniek met gemakkelijk verkrijgbare en betaalbare materialen. We pakken voorkomende valkuilen die vaak niet gemeld, waarin onderzoek vertragen wanneer het optimaliseren van een nieuwe en complexe techniek.
Intracellulaire opname kan een moeilijke techniek om te beheersen vanwege de vele technische trappen. Voor een succesvolle experimenten een aantal belangrijke punten moet worden beschouwd. Ten eerste is het belangrijk om een goed trilling geïsoleerde tafel waarop het experiment werd uitgevoerd hebben. Veel onderzoekers gebruikslucht tabellen, die het tafelblad volledig gescheiden van de basis, waardoor superieure trillingsisolatie. Onze opstelling betreft een dikke marmeren tafel met een zandbak op de top, waarin…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken de late Rudy Limburg voor het vervaardigen van de cardan arm omtrek, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, en Raju Metherate voor het lenen ons apparatuur en Almut Kelber en Kentaro Arikawa, voor bemoediging. Dit werk werd ondersteund door een National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship om KJM en NSF subsidie IOS-1257627 naar ADB
Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
Marble table | |||
Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
Manipulator | Carl Zeiss – Jena | ||
Electrode holder | |||
Specimen stage | |||
Alligator clip wires for grounding | |||
Insulated copper wire | |||
Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
BNC cables | |||
Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
BNC T-adapter | |||
Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
Potassium chloride, 3 M | |||
Slotted plastic tube | |||
Low melting temperature wax | |||
Soldering Iron | Weller | ||
Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
Vaseline | |||
Microsoft Excel | Microsoft |