intracellular रिकॉर्डिंग के electrophysiological तकनीक का प्रदर्शन किया और एक तितली के यौगिक आंखों में एकल फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
Intracellular रिकॉर्डिंग एक शक्तिशाली कैसे निर्धारित करने के लिए एक एकल कोशिका एक दिया प्रोत्साहन का जवाब हो सकता तकनीक का इस्तेमाल किया है। दृष्टि अनुसंधान में, intracellular रिकॉर्डिंग ऐतिहासिक दृष्टि से एक आम अलग तरह के प्रकाश उत्तेजनाओं जाता है कि आज भी इस्तेमाल किया जा रहा करने के लिए अलग-अलग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, वहाँ आंखों में intracellular रिकॉर्डिंग प्रयोगों को दोहराने के लिए बधाई देने के शोधकर्ताओं के लिए साहित्य में विस्तृत कार्यप्रणाली की कमी बनी हुई है। यहाँ हम अधिक आम तौर पर आंख शरीर क्रिया विज्ञान की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में कीट प्रस्तुत करते हैं। कीट फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं आंख की सतह के निकट स्थित हैं और इसलिए तक पहुँचने के लिए आसान कर रहे हैं, और दृष्टि में शामिल तंत्र के कई जंतु संघ भर में संरक्षित कर रहे हैं। हम एक तितली की नजर में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के vivo intracellular रिकॉर्डिंग के लिए बुनियादी प्रक्रिया का वर्णन, ई में थोड़ा पूर्व अनुभव के साथ शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक को और अधिक सुलभ बनाने के लक्ष्य के साथlectrophysiology। हम की जरूरत है, कैसे रिकॉर्डिंग के लिए एक जीवित तितली तैयार करने के लिए, एक ही सेल में एक गिलास microelectrode, और अंत में रिकॉर्डिंग प्रक्रिया ही डालने के लिए कैसे बुनियादी उपकरणों का परिचय। हम भी अलग-अलग प्रकार की कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए कच्चे प्रतिक्रिया डेटा के बुनियादी विश्लेषण समझाओ। हालांकि हमारी संवेदनशीलता का निर्धारण वर्णक्रम प्रोटोकॉल पर केंद्रित है, अन्य उत्तेजनाओं (जैसे, ध्रुवीकृत प्रकाश) और विधि के रूपांतरों इस सेटअप करने के लिए लागू कर रहे हैं।
इस तरह के न्यूरॉन्स के रूप में कोशिकाओं के बिजली के गुणों वोल्टेज या वर्तमान में एक परिवर्तन के रूप में कोशिका झिल्ली भर आयन प्रवाह को मापने के द्वारा मनाया जाता है। electrophysiological तकनीक की एक किस्म की कोशिकाओं में bioelectric घटनाओं को मापने के लिए विकसित किया गया है। जानवरों की आंखों में पाया न्यूरॉन्स पहुंच रहे हैं और उनके circuitry अक्सर मस्तिष्क की तुलना में कम जटिल है, electrophysiological अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं को अच्छा उम्मीदवार बना रही है। आंखों में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की आम अनुप्रयोगों electroretinography (एर्ग) 1,2 और microelectrode intracellular रिकॉर्डिंग शामिल हैं। एर्ग में या एक जानवर की आंख पर एक इलेक्ट्रोड रखने, एक प्रकाश प्रोत्साहन लागू करने, और सभी पास की कोशिकाओं को 3-6 की प्रतिक्रियाओं की राशि के रूप में वोल्टेज में परिवर्तन को मापने शामिल है। यदि एक विशेष व्यक्ति फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता निस्र्पक में रुचि है, अक्सर कई प्रकार की कोशिकाओं को एक साथ एक दिया प्रोत्साहन के लिए अलग अलग शक्तियों पर प्रतिक्रिया; इस प्रकार यहएर्ग डेटा से विशेष प्रकार की कोशिकाओं की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए विशेष रूप से अगर आंख में प्रेतसंबंधी-समान फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के कई अलग अलग प्रकार के होते हैं के लिए मुश्किल हो सकता है। एक संभावित हल आंखों में बहुमत R1-6 कोशिकाओं में व्यक्त ब्याज की फोटोरिसेप्टर (opsin) जीन के साथ ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला बनाने के लिए और फिर ERGs 7 प्रदर्शन करते हैं। इस विधि के संभावित कमियां फोटोरिसेप्टर 8 प्रोटीन की कम अभिव्यक्ति के लिए नहीं है, और पीढ़ी और ट्रांसजेनिक जानवरों की स्क्रीनिंग के लिए लंबे समय सीमा में शामिल हैं। प्रेतसंबंधी अलग फोटोरिसेप्टर के कम प्रकार के साथ आंखों के लिए, रंगीन फिल्टर के साथ आंख के अनुकूलन एर्ग के लिए कुछ प्रकार की कोशिकाओं के योगदान को कम करने के लिए, जिससे वर्णक्रमीय संवेदनशीलता Maxima 9 के आकलन की अनुमति देने के साथ मदद कर सकते हैं।
Intracellular रिकॉर्डिंग एक और तकनीक जहां एक ठीक इलेक्ट्रोड एक सेल impales है और एक प्रोत्साहन के लिए आवेदन किया है। इलेक्ट्रोड रिकॉर्ड ही है कि व्यक्तिidual सेल की प्रतिक्रिया इतनी है कि से रिकॉर्डिंग और कई अलग-अलग कोशिकाओं का विश्लेषण physiologically विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 10-14 के विशिष्ट संवेदनशीलता उपज कर सकते हैं। हालांकि हमारी प्रोटोकॉल वर्णक्रमीय संवेदनशीलता के विश्लेषण पर केंद्रित है, तेज इलेक्ट्रोड के साथ रिकॉर्डिंग intracellular के बुनियादी सिद्धांतों अन्य अनुप्रयोगों के लिए परिवर्तनीय हैं। उदाहरण के लिए, एक नमूना का एक अलग तैयारी का उपयोग करना, और तेज क्वार्ट्ज इलेक्ट्रोड का उपयोग, एक ऑप्टिक पालि या अन्य क्षेत्रों में गहरे से मस्तिष्क में, सवाल के आधार पर कहा जा रहा है रिकॉर्ड कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, अलग-अलग 15 फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया समय, ऑप्टिक में सेल गतिविधि पालियों 16 (पटल, मज्जा या lobula 17), मस्तिष्क 18 या 19 अन्य गैन्ग्लिया भी इसी तरह की तकनीक के साथ दर्ज की जा सकती है, या रंग उत्तेजनाओं ध्रुवीकरण 20 के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता -22 या गति 23,24 उत्तेजनाओं।
Phototransduction, प्रक्रिया है जिसके प्रकाश सेऊर्जा अवशोषित और एक विद्युत संकेत में बदल जाता है, एक प्राचीन विशेषता लगभग सभी वर्तमान दिन जंतु संघ 25 के लिए आम है। दृश्य वर्णक फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में पाया और दृश्य phototransduction शुरुआत के लिए जिम्मेदार rhodopsin है। सभी जानवरों में एक rhodopsins opsin प्रोटीन, 7 transmembrane जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के परिवार के एक सदस्य है, और एक संबद्ध क्रोमोफोर जो रेटिना या इसी तरह के एक अणु 26,27 से प्राप्त होता है से बना रहे हैं। Opsin अमीनो एसिड अनुक्रम और क्रोमोफोर संरचना प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए rhodopsin की absorbance प्रभावित करते हैं। जब एक फोटान क्रोमोफोर द्वारा अवशोषित कर लेता है rhodopsin सक्रिय हो जाता है, कि अंततः सेल झिल्ली ही सीमित आयन चैनल 28 के उद्घाटन की ओर जाता है में एक झरना जी प्रोटीन की शुरुआत। सबसे न्यूरॉन्स के विपरीत, फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं वर्गीकृत संभावित परिवर्तनों है कि प्रकाश प्रोत्साहन बदलने के साथ प्रतिक्रिया आयाम में एक रिश्तेदार परिवर्तन के रूप में मापा जा सकता है गुज़रना पड़ता है। आमतौर पर एक दियाफोटोरिसेप्टर प्रकार केवल एक opsin जीन व्यक्त करता है (हालांकि अपवाद मौजूद 8,10,29-31)। परिष्कृत रंग दृष्टि, कई तरह की रीढ़ और arthropods में पाया, सैकड़ों या फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के हजारों हर एक या कभी कभी अधिक rhodopsin प्रकार व्यक्त करने का एक जटिल आँख के साथ हासिल की है। विजुअल जानकारी आंख और मस्तिष्क में तंत्रिका जटिल डाउनस्ट्रीम संकेतन के माध्यम से फोटोरिसेप्टर पच्चीकारी से अधिक प्रतिक्रियाओं की तुलना, एक छवि रंग और गति के साथ पूरा की धारणा में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा कब्जा कर लिया है।
intracellular रिकॉर्डिंग के माध्यम से प्रकाश के विभिन्न तरंग दैर्ध्य के लिए एक फोटोरिसेप्टर सेल के कच्चे प्रतिक्रियाओं को मापने के बाद, यह अपने वर्णक्रम संवेदनशीलता की गणना करने के लिए संभव है। इस गणना Univariance के सिद्धांत, जिसमें कहा गया है कि एक फोटोरिसेप्टर सेल की प्रतिक्रिया फोटॉनों यह अवशोषण की संख्या पर निर्भर है, लेकिन फोटॉनों यह अवशोषण 32 की विशेष गुणों पर नहीं पर आधारित है। किसी भी फोटोन abso है किrhodopsin द्वारा rbed प्रतिक्रिया की इसी तरह प्रेरित करेगा। अभ्यास में, इसका मतलब है कि एक सेल के कच्चे प्रतिक्रिया आयाम या अपने चरम की ओर संवेदनशीलता तरंग दैर्ध्य में बदलाव करने के लिए या तो प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि (अधिक फोटॉनों अवशोषित करने के लिए) की वजह से वृद्धि होगी, (rhodopsin की संभावना अधिक है कि तरंग दैर्ध्य को अवशोषित)। हम जानते तीव्रता और तरंग दैर्ध्य अलग प्रतिक्रियाओं के लिए एक ही तरंग दैर्ध्य और एक ही तीव्रता लेकिन अज्ञात रिश्तेदार संवेदनशीलता पर सेलुलर प्रतिक्रियाओं संबंधित में इस सिद्धांत का इस्तेमाल करते हैं। सेल प्रकार अक्सर तरंगदैर्ध्य, जिस पर उनकी संवेदनशीलता चोटियों से पहचाने जाते हैं।
यहाँ हम व्यापक अनुसंधान समुदाय के लिए इस विधि और अधिक सुलभ बनाने पर ध्यान देने के साथ intracellular रिकॉर्डिंग और एक तितली की नजर में फोटोरिसेप्टर के वर्णक्रमीय संवेदनशीलता के विश्लेषण के लिए एक विधि बताते हैं। हालांकि intracellular रिकॉर्डिंग साहित्य में आम बनी हुई है, विशेष रूप से कीड़ों में रंग दृष्टि के लिए सम्मान के साथ, हम था पाया हैसामग्री और तरीके का वर्णन टी आम तौर पर भी तकनीक के प्रजनन के लिए अनुमति देने के लिए संक्षिप्त कर रहे हैं। हम इसकी आसान प्रतिकृति की अनुमति देने के उद्देश्य से वीडियो प्रारूप में इस विधि प्रस्तुत करते हैं। हम यह भी आसानी से प्राप्य और सस्ती उपकरणों का उपयोग तकनीक का वर्णन है। हम आम निरंतर कि अक्सर रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं, जो अनुसंधान धीरे जब एक नया और जटिल तकनीक के अनुकूलन पता।
Intracellular रिकॉर्डिंग शामिल कई तकनीकी कदम के कारण मास्टर करने के लिए एक मुश्किल तकनीक हो सकता है। सफल प्रयोगों के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, यह एक अच्छी तरह से vibrationally-पृथक ट…
The authors have nothing to disclose.
हम प्रोत्साहन के लिए हमें ऋण देने के लिए उपकरण Cardan हाथ परिधि, किम्बर्ली जैमिसन, मैथ्यू मैकहेनरी, और राजू Metherate fabricating के लिए देर रूडी लिम्बर्ग धन्यवाद, और Almut Kelber और Kentaro Arikawa। यह काम एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप और KJM करने के लिए NSF अनुदान IOS-1,257,627 एडीबी द्वारा समर्थित किया गया
Butterfly pupae | Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits | ||
Large plastic cylinder | Any chamber that remains humidified will work | ||
Insect pins, size 2 | BioQuip | 1208B2 | |
100% Desert Mesquite Honey | Trader Joe's | Any honey or sucrose solution will work | |
Xenon Arc Lamp | Oriel Instruments | 66003 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Universal Power Supply | Oriel Instruments | 68805 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Optical Track | Oriel Instruments | 11190 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Large (2x) | Oriel Instruments | 11641 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Rail Carrier, Small (4x) | Oriel Instruments | 11647 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10 | Newport Corporation | TA-8Q20-10 | |
Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 & 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | SP-1 | |
No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x) | Newport Corporation | VPH-2 | |
Fixed lens mount, 50.8 mm | Newport Corporation | LH-2 | |
Fixed lens mount, 25.4 mm | Newport Corporation | LH-1 | |
Condenser lens assembly | Newport Corporation | 60006 | |
Convex silica lens, 50.8 mm | Newport Corporation | SPX055 | |
Six Position Filter Wheel, x2 | Newport Corporation | FW1X6 | |
Filter Wheel Mount Hub | Newport Corporation | FWM | |
Concave silica lens, 25.4 mm | Newport Corporation | SPC034 | |
Collimator holder | Newport Corporation | 77612 | |
Collimating beam probe | Newport Corporation | 77644 | |
Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule | Newport Corporation | 77670 | This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder |
600 μm diameter UV-vis fiber obtic cable | Oriel Instruments | 78367 | Oriel is now a part of Newport Corporation |
Shutter with drive unit | Uniblitz | 100-2B | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD | Newport | FRQ-ND01 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD | Newport | FRQ-ND03 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD | Newport | FRQ-ND05 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD | Newport | FRQ-ND10 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD | Newport | FRQ-ND30 | |
UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD | Newport | FRQ-ND50 | |
LS-1-Cal lamp | Ocean Optics | LS-1-Cal | |
Spectrometer | Ocean Optics | USB-2000 | |
SpectraSuite Software | Ocean Optics | ||
Interference bandpass filter, 300 nm | Edmund Optics | 67749 | |
Interference bandpass filter, 310 nm | Edmund Optics | 67752 | |
Interference bandpass filter, 320 nm | Edmund Optics | 67754 | |
Interference bandpass filter, 330 nm | Edmund Optics | 67756 | |
Interference bandpass filter, 340 nm | Edmund Optics | 65614 | |
Interference bandpass filter, 350 nm | Edmund Optics | 67757 | |
Interference bandpass filter, 360 nm | Edmund Optics | 67760 | |
Interference bandpass filter, 370 nm | Edmund Optics | 67761 | |
Interference bandpass filter, 380 nm | Edmund Optics | 67762 | |
Interference bandpass filter, 390 nm | Edmund Optics | 67763 | |
Interference bandpass filter, 400 nm | Edmund Optics | 65732 | |
Interference bandpass filter, 410 nm | Edmund Optics | 65619 | |
Interference bandpass filter, 420 nm | Edmund Optics | 65621 | |
Interference bandpass filter, 430 nm | Edmund Optics | 65622 | |
Interference bandpass filter, 440 nm | Edmund Optics | 67764 | |
Interference bandpass filter, 450 nm | Edmund Optics | 65625 | |
Interference bandpass filter, 460 nm | Edmund Optics | 67765 | |
Interference bandpass filter, 470 nm | Edmund Optics | 65629 | |
Interference bandpass filter, 480 nm | Edmund Optics | 65630 | |
Interference bandpass filter, 492 nm | Edmund Optics | 65633 | |
Interference bandpass filter, 500 nm | Edmund Optics | 65634 | |
Interference bandpass filter, 510 nm | Edmund Optics | 65637 | |
Interference bandpass filter, 520 nm | Edmund Optics | 65639 | |
Interference bandpass filter, 532 nm | Edmund Optics | 65640 | |
Interference bandpass filter, 540 nm | Edmund Optics | 65642 | |
Interference bandpass filter, 550 nm | Edmund Optics | 65644 | |
Interference bandpass filter, 560 nm | Edmund Optics | 67766 | |
Interference bandpass filter, 570 nm | Edmund Optics | 67767 | |
Interference bandpass filter, 580 nm | Edmund Optics | 65646 | |
Interference bandpass filter, 589 nm | Edmund Optics | 65647 | |
Interference bandpass filter, 600 nm | Edmund Optics | 65648 | |
Interference bandpass filter, 610 nm | Edmund Optics | 65649 | |
Interference bandpass filter, 620 nm | Edmund Optics | 65650 | |
Interference bandpass filter, 632 nm | Edmund Optics | 65651 | |
Interference bandpass filter, 640 nm | Edmund Optics | 65653 | |
Interference bandpass filter, 650 nm | Edmund Optics | 65655 | |
Interference bandpass filter, 660 nm | Edmund Optics | 67769 | |
Interference bandpass filter, 671 nm | Edmund Optics | 65657 | |
Interference bandpass filter, 680 nm | Edmund Optics | 67770 | |
Interference bandpass filter, 690 nm | Edmund Optics | 65659 | |
Interference bandpass filter, 700 nm | Edmund Optics | 67771 | |
Faraday cage | Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup. | ||
Stereomicroscope, 6x, 12x, 25x, 50x magnification | Wild Heerbrugg | Wild M5 | Any Stereomicroscope will do |
Microscope stand with swinging arm and heavy base | McBain Instruments | Any heavy base with arm will do | |
Cardan arm | Custom built, See Figure 4 | ||
Fiber-lite high intensity illuminator | Dolan-Jenner | MI-150 | For lighting specimen |
Fiber-lite goose-neck light guide | Dolan-Jenner | EEG 2823 | Any goose-neck light guide will do |
Marble table | |||
Raised wooden table | Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath | ||
Wooden box filled with sand | custom built, any box with sand | ||
Manipulator | Carl Zeiss – Jena | ||
Electrode holder | |||
Specimen stage | |||
Alligator clip wires for grounding | |||
Insulated copper wire | |||
Silver wire, 0.125 mm diameter | World Precision Instruments | AGW0510 | |
BNC cables | |||
Preamplifier with headstage | Dagan Corporation | IX2-700 | |
Humbug Noise reducer | Quest Scientific | Humbug | |
Oscilloscope, 30MHz, 2CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe | EZ Digital | os-5030 | |
BNC T-adapter | |||
Powerlab hardware 2/20 | ADI instruments | ML820 | |
Labchart software | ADI instruments | Chart 5 | |
10 MHz Pulse Generator | BK Precision | 4030 | |
Glass pipette puller | Sutter Instruments | P-87 | |
Borosillicate glass capillaries with filament | World Precision Instruments | 1B120F-4 | |
Potassium chloride, 3 M | |||
Slotted plastic tube | |||
Low melting temperature wax | |||
Soldering Iron | Weller | ||
Platform with ball-and-socket magnetic base | Hama photo and video | ||
Double edge carbon steel, breakable razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72004 | |
Vaseline | |||
Microsoft Excel | Microsoft |