प्रोटीन अभिव्यक्ति और सह स्थानीयकरण मल्टिप्लेक्स इम्यूनो-histochemical धुंधला और multispectral इमेजिंग का उपयोग के quantitation
Summary
Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.
Abstract
Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.
Introduction
Immunohistochemistry (आईएचसी) ऊतक के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक मानक प्रयोगशाला तकनीक है, और अभी भी व्यापक रूप आईएचसी दोनों अनुसंधान और नैदानिक विकृति में प्रयोग किया जाता है। आईएचसी धुंधला के मूल्यांकन अक्सर परिणामों की व्याख्या में संभावित पूर्वाग्रह शुरू अर्द्ध मात्रात्मक है। कई अर्द्ध मात्रात्मक दृष्टिकोण विकसित किया गया है जो अंतिम निदान 1-4 में दोनों धुंधला तीव्रता और धुंधला हद तक शामिल। अन्य प्रणालियों के लिए बेहतर अभिव्यक्ति 5 स्थानीयकरण करने में स्कोरिंग तीव्रता और subcellular स्थान शामिल हैं। औसत कई दर्शकों से स्कोर का निगमन अक्सर क्रम में एक दर्शक के पूर्वाग्रह 6 के प्रभाव को कम करने के लिए उपयोग किया जाता है। इन प्रयासों के बावजूद, विश्लेषण में आत्मीयता अभी भी बनी हुई है, खासकर जब धुंधला हो जाना 7 की हद तक का मूल्यांकन। प्रोटोकॉल मानकीकरण और मानव इनपुट से आत्मीयता को कम से कम सही, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य आईएचसी परिणाम बनाने के लिए सर्वोपरि है।
सामग्री "> ऊतकों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने के लिए आईएचसी के अलावा अन्य विकल्प नहीं है। अनुसंधान की स्थापना के भीतर, immunohistochemistry परंपरागत रूप से, प्रोटीन स्थानीयकरण 8 की जांच के लिए एक साधन के रूप में देखा गया है, जबकि इस तरह के immunoblotting के रूप में अन्य तकनीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए सोने के मानक के रूप में देखा जाता है । निर्धारण ऊतक या सेल डिब्बे विशिष्ट अभिव्यक्ति इस तरह के सेल विभाजन या लेजर कब्जा microdissection 9,10 के रूप में उन्नत तकनीकों को शामिल करने के बिना मुश्किल है। ऊतक स्लाइड पर फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग एक उचित समझौता प्रदान करता है, लेकिन NADPH के कारण पृष्ठभूमि autofluorescence, lipofuscins, जालीदार फाइबर, कोलेजन और elastin सटीक quantitation मुश्किल 11 बना सकते हैं।स्वचालित कम्प्यूटेशनल विकृति प्लेटफार्मों विकृति धुंधला 12-15 से अधिक उद्देश्य quantitation के लिए एक होनहार दिशा रहे हैं। ऊतक के साथ multispectral इमेजिंग का मेलबड़ा नमूना आकार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च throughput विश्लेषण की सुविधा। इन तकनीकों के साथ, प्रोटीन सह स्थानीयकरण, धुंधला विविधता, और ऊतक और subcellular स्थानीयकरण के विश्लेषण संभव है, जबकि काफी हद तक दोनों निहित पूर्वाग्रहों और विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करते हुए स्पष्ट प्रारूप 16 से एक सतत में डेटा लौटने के बजाय है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य, विश्लेषण के साथ मल्टिप्लेक्स immunohistochemistry प्रदर्शन multispectral इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए की उपयोगिता और कार्यप्रणाली प्रदर्शित करने के लिए किया गया था।
इस प्रोटोकॉल चार अनुकूलित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक एकल ऊतक अनुभाग स्लाइड के मैनुअल, मल्टीप्लेक्स immunohistochemical धुंधला के लिए लिखा है। एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, परमाणु विरोधी खरगोश एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) और एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) झिल्ली ही सीमित विरोधी माउस CD147 और झिल्ली ही सीमित विरोधी माउस ई cadherin के साथ मल्टिप्लेक्स रहे हैं। पसंद के किसी भी एंटीबॉडी substitut जा सकता हैइस के साथ साथ सूचीबद्ध एंटीबॉडी के लिए एड, लेकिन एंटीबॉडी के प्रत्येक संयोजन अलग अनुकूलन की आवश्यकता है। सभी एंटीबॉडी के लिए पूर्व उपचार के लिए समान होना चाहिए। ए.आर. और CD147 एंटीबॉडी को व्यक्तिगत रूप से और फिर एक कॉकटेल के रूप में अनुकूलित किया जाना चाहिए। प्रत्येक एंटीबॉडी एक बायोटिन मुक्त बहुलक प्रणाली और 4 अद्वितीय chromogens में से एक का उपयोग कर पता लगाया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन के लिए पारंपरिक immunohistochemistry का उपयोग व्यक्तिपरक, विश्लेषण 22,23 के अर्द्ध मात्रात्मक तरीकों द्वारा सीमित है। एडवांस प्लेटफार्मों बायोमार्कर अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों, पैथोलॉजी प्रयोगशाला में विस्कॉन्सिन ट्रांसलेशनल अनुसंधान पहल विश्वविद्यालय धन्यवाद हिस्सा पैथोलॉजी प्रयोगशाला और दवा के UW विभाग द्वारा समर्थित और UWCCC अनुदान P30 CA014520 में अपनी सुविधाओं और सेवाओं के उपयोग के लिए।
Materials
| Xylene | Fisher Chemical | X3F1GAL | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| Ethyl Alcohol-200 proof | Fisher Scientific | 4355223 | NFPA rating:Health – 0, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
| Tris Hydroxymethyl aminomethane HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 0 , Reactivity-0 |
| Tween 20 | Chem-Impex | 1512 | NFPA rating:Health – 0, Fire –1 , Reactivity-0 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP2944-100 | NFPA rating:Health – 1, Fire –0 , Reactivity-0 |
| Peroxidazed | Biocare Medical | PX968 | Avoid contact with skin and eyes. May cause skin irritation and eye damage. |
| Diva Decloaker | Biocare Medical | DV2004 | This product has been classified as non‐hazardous based on the physical and/or chemical nature and/or concentration of ingredients. |
| Estrogen Receptor alpha | Thermo Fisher Scientific-Labvision | RM9101 | Not classified as hazardous |
| Androgen Receptor | SCBT | sc-816 | Not classified as hazardous |
| CD147 | Biodesign | P87535M | Not classified as hazardous |
| E-cadherin | Dako | M3612 | Not classified as hazardous |
| Renoir Red Andibody Diluent | Biocare Medical | PD904 | It is specially designed to work with Tris-based antibodies |
| DeCloaking Chamber | Biocare Medical | Model DC2002 | Take normal precautions for using a pressure cooker |
| Barrier pen-Immuno Edge | Vector Labs | H-4000 | |
| Denaturing Kit-Elution step | Biocare Medical | DNS001H | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit HRP Polymer | Biocare Medical | RHRP520 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Rabbit AP Polymer | Biocare Medical | RALP525 | Not classified as hazardous |
| Mach 2 Goat anti-Mouse HRP Polymer | Biocare Medical | M3M530 | Not classified as hazardous |
| Betazoid DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | BDB2004 | 1. DAB is known to be a suspected carcinogen. 2. Do not expose DAB components to strong light or direct sunlight. 3. Wear appropriate personal protective equipment and clothing. 4. DAB may cause sensitization of skin. Avoid contact with skin and eyes. 5. Observe all federal, state and local environmental regarding disposal |
| Warp Red Chromogen Kit | Biocare Medical | WR806 | Corrosive. Acid that may cause skin irritation or eye damage. |
| Vina Green Chromogen Kit | Biocare Medical | BRR807 | Harmful if swallowed |
| Bajoran Purple Chromogen Kit | Biocare Medical | BJP807 | Flammable liquid. Keep away from heat, flames and sparks. Harmful by ingestion or absorption. Avoid contact with skin or eyes, and avoid inhalation. |
| Cat Hematoxylin | Biocare Medical | CATHE | Purple solution with a mild acetic acid (vinegar) scent. May be irritating to skin or eyes. Avoid contact with skin and eyes. Avoid ingestion. |
| XYL Mounting Media | Richard Allen | 8312-4 | NFPA rating:Health – 2, Fire – 3 , Reactivity-0 |
| 1.5 Coverslips | Fisher Brand | 22266858 | Sharp edges |
| Incubation (Humidity)Chamber | obsolete | obsolete | Multiple vendors available |
| Convection Oven | Stabil- Therm | C-4008-Q | |
| Background Punisher Blocking Reagent | Biocare Medical | BP974 | This product is not classified as hazardous. |
| inForm software | PerkinElmer | CLS135781 | Primary multispectral imaging software used in manuscript |
| Nuance software | PerkinElmer | NUANCEEX | Software used for making spectral libraries within manuscript |
| Vectra microscope and slide scanner | PerkinElmer | VECTRA | Automated slide scanner and microscope for obtaining IM3 image cubes |
References
- Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
- Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
- Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
- McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
- Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
- Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
- Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
- Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
- Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
- Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
- Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42 (2012).
- Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102 (2014).
- Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
- Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549 (2015).
- Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
- Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry–issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
- Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).
