Récolte sélective de Marginating-pulmonaires Leucocytes
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
Leucocytes adhérant aux capillaires des poumons ( par exemple, marginating-pulmonaire (MP) leucocytes) 1 ont été montrées pour présenter la composition leucocytaire distincte et une activité unique par rapport aux leucocytes d'autres compartiments immunitaires (par exemple, la circulation, de la rate, la moelle osseuse) 2- 4. Par exemple, exposition MP-leucocytes plus tueuses naturelles (cellules NK) cytotoxicité contre les cellules tumorales différentes, par rapport à circulants et spléniques cellules NK, ainsi que l'ARN messager différencié (ARNm) niveaux et augmentation de la sécrétion de cytokines pro- et anti-inflammatoires. La composition des cellules est également différenciée des leucocytes circulants comme MP-leucocytes ont un rapport plus élevé de l'immunité innée / adaptative par rapport aux leucocytes circulants (50% contre 30%, respectivement). L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective de MP-leucocytes, afin d'étudier ce compartiment immunitaire important et unique (population cellulaire), et elucIDATE l'impact des diverses manipulations (par exemple, l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.
Pour comprendre l'importance de cette population unique, il est important de noter que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles par des fonctions in vivo de l' immunité à médiation cellulaire (CMI). Cette capacité est évidente malgré l'échec précédent du système immunitaire pour contrôler la tumeur primaire, et amplement étayée par des preuves in vivo chez des patients cancéreux et des modèles animaux 5. Surtout, ces résultats sont souvent incompatibles avec in vitro et ex vivo études qui rapportent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par la circulation des leucocytes dans des échantillons de sang chez les humains et les animaux (mesuré par les essais de cytotoxicité) 6,7. Cet écart peut être attribué à l'existence in vivo des populations leucocytaires distincts, tels que mentionnés ci lesusmentionné population leucocytaire MP, et plus particulièrement son sous – population de cellules NK activées 3. En effet, les cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélés être résistants à la circulation et les leucocytes spléniques, se sont révélés être lysées par les cellules NK-MP 3,8. Ainsi, les cellules prétendument «NK» résistantes MADB106 qui produisent des métastases aux poumons de fischer344 (F344), les rats sont contrôlés par des cellules NK-MP, mais pas par circulation ou des cellules NK spléniques qui sont couramment étudiées compte tenu de leur facilité d'accès.
MP-leucocytes purifiés actifs et ne sont pas accessibles par les méthodes classiques de récolte de leucocytes dans les poumons, qui sont basés sur un broyage du tissu pulmonaire ou la dégradation biologique 9. Notre approche présente deux avantages majeurs par rapport aux approches de traitement des tissus. Tout d'abord, la méthode de perfusion récolte sélective MP-leucocytes, en les séparant des autres cellules qui proviennent du parenchyme pulmonaire interstitielle et compar broncho-alvéolairetments. En second lieu, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité et le milieu physiologique de la MP-leucocytes, à la différence du broyage et le traitement biologique des approches qui endommagent les cellules, modifier leur morphologie et induisent la production et la libération de divers facteurs qui modulent l'activité immunitaire et plus particulièrement répriment NK 10 cytotoxicité.
Les poumons sont un organe cible majeure pour les métastases du cancer et pour diverses maladies infectieuses. Toutes les cellules cancéreuses circulantes et des cellules infectées passent à travers les capillaires pulmonaires où ils ont besoin de se déformer et d'interagir avec des cellules endothéliales capillaires et les leucocytes résidents. Dans ces conditions, les cellules circulantes peuvent être facilement ciblés par MP-leucocytes résidents. Il semble donc intéressant de disposer biologiquement leucocytes activés dans ce compartiment immunitaire, et il est important d'étudier cette MP-population unique dans différents milieux biologiques, expérimentaux et cliniques. Il est digne de noter que syl' activation stemic immunitaire par divers-réponse modificateurs biologiques (par exemple l' acide polyinosinique-polycytidylique (poly I: C) ou de type C CpG ODN (CpG-C ODN)) ont été montrés pour activer MP-leucocytes plus de leucocytes circulants 3, 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici permet la récolte sélective et à l'étude de la population unique de MP-leucocytes. Par rapport à la circulation des leucocytes ou splénique, la population de MP se caractérise par une composition distincte de sous – populations leucocytaires, les niveaux plus élevés d'activation, la libération ultérieure de diverses cytokines et des niveaux plus élevés d' ARNm de cytokines pro- et anti-inflammatoires 2,3. Plus précisément, nous avons montré que les cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs et ces travaux ont été soutenus par le NIH / NCI subvention # R01CA172138 (à SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
References
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