Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
En hidtil ukendt dissektion og optagelse teknik er beskrevet for optisk overvågning farvning og de-farvning af lancetformede terminaler omkring hårsækkene i huden af mus pinna. Præparatet er enkel og relativt hurtigt, pålideligt giver omfattende regioner af flere mærkede enheder af levende nerve terminaler til at studere optagelse og frigivelse af styryl pyridinium farvestoffer udstrakt grad anvendes i studier af vesikel genbrug. Inddele forberedelserne før mærkning tillader test vs. kontrol sammenligninger i samme øre fra et enkelt individ. Nyttige tips er givet for at forbedre kvaliteten af forberedelsen, mærkningen og de billeddannende parametre. Det nye system er velegnet til analyse farmakologisk og mekanisk induceret optagelse og frigivelse af disse vitale farvestoffer i lancetformede terminaler i både vildtype og genetisk modificerede dyr. Eksempler på modulatoriske indflydelse på mærkning intensitet er givet.
Mechanosensory nerveender er typisk små, fordelt diffust og vanskeligt tilgængelige in situ, da de normalt er begravet dybt i huden eller andre omgivende væv. Visualisere dem derfor sædvanligvis kræver sektionering efterfulgt af en langvarig immunolabeling / farvning periode, eller forsinkelsen og dyrt at opnå muselinjer med genetisk ekspression af fluorescerende mærker såsom grøn eller gul fluorescerende protein (GFP / YFP) 1. Her viser vi en bekvem væv og en hurtig og enkel metode til at få adgang til et stort antal hårsækken afferenter for at studere, og hvordan de kan hurtigt mærkes til optisk overvågning af terminal funktion 2. Med praksis, kan hele teknik fra dissektion til billedbehandling være afsluttet i så lidt som 2 timer.
De lancetformede terminaler af sensoriske axoner innerverer hårsækkene i pattedyr danne palisader omkring epitelet af hår-follicle, med hverterminal indlagt mellem glial / Schwann celleprocesser 2-4. Formålet med terminalerne er at påvise mekanisk forskydning af hårene de omgiver. De er en blanding af hurtigt og langsomt tilpasning endelser, men de overvejende producerer korte byger af aktivitet som respons på håret bevægelse. Typisk brændingen stopper meget hurtigt, når bevægelse ophører, selv i nærvær af en fortsat forskydning.
Denne murine pinna model til undersøgelse lancetformede terminaler ved optiske metoder har mange fordelagtige træk til undersøgelse af strukturen og funktionen af disse endelser. Pinna er overvejende to lag af huden apposed back-to-back, med kun en lille mængde af bruskvæv mellem. Huden er meget tynd og let dissekeret grund af minimale mængder af svagt klæbende bindevæv i forhold til andre områder af kroppen. De let adskilte hudlag derfor giver god adgang til de hårsække og terminaler. Den innervationer let tilgængelig og kan identificeres. Hårsækkene mere tyndt fordelt end i andre hudområder, lette billeddannelse af individuelle eller små grupper af follikler. Den tynde underliggende hudlag giver god tilgængelighed til farvestoffer og farmakologiske stoffer, så er ideel til billeddannelse ved fluorescens mikroskopi uden yderligere forarbejdning. Den billeddannelse af mærkede terminaler kan enten være af levende terminaler eller, hvis du bruger en fixable farvestof analog, efter fiksering og yderligere histologisk behandling.
Vi har brugt dette præparat at vise, at membranen genbrug opstår i lancetformede slutninger, fremgår af optagelse (endocytose) og frigivelse (exocytose) af en styryl pyridinium farvestof (FM1-43, N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromid). Farvestoffet dog ikke, synes i væsentlig grad at mærke investerer Schwann celle processer 2. Vi viste også, at denne farvestofoptagelse / release og dermed membran recycling, er underlagt glutamaterge modulation gennem en atypisk (phospholipase D-koblede) metabotrop glutamat receptor. Resultaterne af enkle stimulation og analyse protokoller er illustreret, og fælles potentielle analyse spørgsmål er også fremhævet.
Bewick og Betz oprindeligt udviklet N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium dibromide-relateret styryl pyridinium farvestoffer 7-10 at overvåge lokal genanvendelse af synaptisk vesikel membran. Farvestofoptagelse og dermed forøget fluorescens, afspejler derfor synaptisk vesikel membran internalisering (endocytose). Efterfølgende dette internaliserede farvestof kan genudgivet ved yderligere elektrisk aktivitet, viser tab farvestof overvåger vesikel membran eksternalisering (exocytose). I synapser, dette er en proxy for neurotransmitter sekretion. Samtidig, vi også fundet disse farvestoffer mærke primære mechanosensory nerveender 7. For nylig 11, Bewick, Banker og kolleger derefter viste, at dette afspejler en lignende proces i modne, differentierede mechanosensory terminaler ex vivo. Også her farvestofferne mærke 50 nm diameter 'synaptiske-lignende' vesikler (Slvs), der genbruger konstitutivt at frigive glutamat.I mechanosensory terminaler, i modsætning til deres synaptiske kolleger, dette genbrug er primært spontan. Det er også moduleres ved mekanisk, snarere end blot elektrisk stimulering.
For sensoriske neuroner i kultur og i cochlea hårceller, styrylfarvestoffer i almindelighed og styryl pyridinium farvestof i særdeleshed har vist sig at passere gennem mechanosensory kanaler, blokerer mechanosensory kanaler og irreversibelt mærkning interne membraner 12. Men ved sammenlignelige koncentrationer styrylfarvestof i differentierede mechanosensory terminaler i stedet, som her i lancetformede endelser 2, eller i Ia slutninger i muskel spindler 11, og i hårceller, der ikke er mekanisk stimuleres 13, 14, mærkning, er ved membran endocytose. I mechanosensory nerveender, f.eks mærkning er reversibel og ikke blokerer mechanosensory responser ved de anvendte koncentrationer her 2, 11, 1Fem. Mens nogle farvestof internalisering af kanal gennemsivning i disse endelser ikke helt kan udelukkes, at næsten total affarvning med latrotoxin indikerer det store flertal af mærkningen i modne terminaler, er ved internalisering med genbrug vesikel membran. Vi har derfor anvendt denne teknik til at studere aktiviteten afhængighed 11 og senest farmakologien 2 af SLV genbrug i mechanosensory afferente terminaler ved at undersøge narkotika effekter på optagelse og frigivelse af farvestoffer.
Som med de fleste praktiske teknikker, reproducerbarhed kræver gentagelse og praksis. Nogle af de vigtigste punkter for at sikre pålidelighed vil nu blive diskuteret. Lancetformede mærkning hos yngre dyr er mere pålidelige – den mindste dyr, vi har brugt var 15 g kropsvægt. Det er ikke helt klart, hvorfor dette er tilfældet, men det kan skyldes, dissektion af den yngre bindevæv kræver mindre mekanisk traume og leaves mindre tilbageværende remanens ved fjernelse vævene ligger over innervation lag.
Samlet set præparatets væv er ganske enkel, med peeling huden lag fra hinanden er den mest teknisk udfordrende praktiske aspekt, og da kun i ældre mus. I disse hudlagene klæber kraftigt sammen ved bunden, hvor dissektion starter, men selv her adskillelse af lagene bliver meget lettere mod kanten. Heldigvis, eller måske følgelig disse tyndere marginale hudområder normalt giver den mest tilfredsstillende mærkning, som gør den forreste huden generelt. Derfor især undgå at tage fat i meget tynde hud på marginerne. For at minimere risikoen for skader, manipulere forberedelserne indirekte ved at skubbe med lukkede pincet i stedet gribe direkte, eller hvis det er væsentligt fatte kun skrappere væv som ikke vil kunne mærkes. Være grundig med at fjerne 'ark polystyren »lag ligger umiddelbart over folliklerne, da dette er den vigtigste migniske obstruktion til billeddannelse og adgang lægemiddel. Imidlertid er det vigtigt at minimere fysisk kontakt med underliggende strukturer, da dette skader (dvs. strimler væk) de neurale net og terminaler lige nedenfor. Hvis den dominerende fluorescens er gul / hvid i talgkirtlerne, fremtrædende auto-fluorescens af håret baser og få halvmåner af appelsin / gul lancetformede slutninger, indikerer dette nerve plexus lag og tilhørende lancetformede terminaler er fjernet under clearance. Dette synes at være det største problem med ældre (> 30 g) mus. Gennem farvningsprocedurer, sikre, at alt er på 30 ° C og godt iltet. Vær opmærksom på, at mærkede terminaler er stadig i live. Følgelig vil farvestof udskilles af igangværende spontan (konstitutiv) exocytisk frigivelse. Dette vil være langsommere på R / T, men det er god praksis at minimere forsinkelsen mellem fjernelsen af chelator løsning og billedbehandling, for at minimere tab farvestof. Desuden for mellem-grupper komparative studies af intensitet, er det vigtigt at sikre billeddannelse af alle grupper er tid-matchet. Anvendelse af et farvestof-chelatdanner før billedbehandling forbedrer kontrasten. Så mens relativt dyre, chelatering trin er ganske vigtigt for at sikre en god billedkvalitet. Chelator brug kan minimeres ved at genbruge opløsningen flere gange, og endda på 2 – 3 på hinanden følgende dage, hvis de opbevares ved 4 ° C mellem anvendelser. Kassér chelator løsning, når det går mærkbart pink, viser sin farvestof beslaglæggelse nærmer mætning.
Under billedbehandling, være klar over potentialet for fototoksisk beskadigelse disse levende terminaler, som er en kumulativ resultat af både intensiteten og behandlingstid af excitationslyset. Denne overvejelse er mindre vigtigt for enkelt tidspunkterne billeder, hvor billedkvaliteten er den primære bekymring. er imidlertid afgørende under gentagen billeddannelse i kinetikundersøgelser at reducere excitationslys eksponering til et minimum. Mens udviklingen af disse farvestoffer tillabel synapser, fandt vi excitation for> 1 min ved fuld effekt excitation belysning vil medføre dramatiske og uoprettelige skader på nerveender. De først efterfølgende ekspandere enormt, så kollapsede fuldstændigt over et tidsrum på ~ 15 min. Vi har ikke systematisk teste de relative bidrag eksponeringstid og intensitet, men disse observationer tyder det ledende princip bør være at minimere begge. Så anbefales det, at excitationslyset intensitet og varighed er minimum står mål med at få gode billeder, og passende billeder kontrol er taget i tide-kursus undersøgelser. For at teste, at oplysningerne ikke er påvirket af fototoksicitet under gentagne imaging betingelser, på hvert tidspunkt tage en ekstra billede af en tidligere ikke set terminal. Dette er for at sikre adfærd mærkningen i naive terminaler ligner i hårsække, der afbildes gentagne gange.
En række faktorer kan reducere inden-gruppen variabilitet af nettointensitet data. Præcis placering af ROI'er, især baggrunden ROI, er vigtig, da selv små områder af uhensigtsmæssig farvning i høj grad kan påvirke mellem-follikel data variabilitet. Variabiliteten af nettointensitet er også påvirket af, hvordan helt hver hårsæk er omgivet af palisaden af slutninger. Sammenlign for eksempel halvmåneformede fordeling mærkning i figur 1B med næsten fuldstændig cirkulært mønster ses i figur 2. Mere kompleks analyse, måske ved hjælp af automatiseret software påvisning og tærskelværdier, er nødvendige, hvis graden af omringning er en relevant parameter. Bemærk venligst, at intensitet distributioner for selv de mest præcist analyserede follicle grupper ikke normalt fordelt (se figur 3), hvilket nødvendiggør brugen af ikke-parametrisk statistik for mellem-behandling sammenligninger af befolkningens medianer snarere end hjælp. Normalisering teknikker, såsom ekspression intensiteter i procent of kontralateral kontrol eller for en kontrolgruppe bestående af flere præparater, kan anvendes til yderligere at reducere variabilitet. Den endelige tekniske element, der skal overvejes, er den eksperimentelle design for farmakologisk testning. Under farmakologiske undersøgelser, præinkuberes præparatet i lægemiddelopløsningen i 30 min før farvestof ansøgning. Derefter opretholde lægemiddelkoncentrationen i farveopløsningen. I kontroller anvendes enten saltvand eller, hvis lægemidlet er opløst i et køretøj, saltvand plus køretøj.
Denne artikel viser, hvordan denne nye pinna forberedelse tilbyder kvalitet billeder af mechanosensory slutninger højt huden med minimal forberedelse. Vi viser også, at det kan anvendes til at undersøge farmakologien af to kritiske aspekter af vesikel genanvendelse. Vi viser først, at en glutamat-receptor-agonist kan øge farvestof internalisering (en markør for endocytose), og for det andet, er det farvestof tabt igen med latrotoxin (en stimulans af exocytose). Betydningen af denne forberedelse;ion og teknik er, at det giver fremragende adgang til levende hud mechanosenory terminaler på stedet for billeddannelse eksperimenter, der giver unikke muligheder for optisk overvågning af terminal funktion, struktur og deres indbyrdes relationer. Til det sidstnævnte formål har vi også udviklet det videre til brug i kombinerede optiske / elektrofysiologiske undersøgelser (se søster JOVE artikel for detaljer).
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev finansieret af UK Medical Research Council projekttilskud G0601253 til GSB og RWB og en SULSA Bioskape tilskud til GSB
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |