Tavuk İşitsel Organ gen Transferi tarafından<em> Ovo olarak</em> Mikro-elektroporasyon
Summary
The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.
Abstract
Tavuk embriyo gen fonksiyonunun manipülasyonlar ovo göreli kolaylıkla yapılabilir embriyonik gelişme çalışmak için ideal bir model sistemleridir. iç kulak işitme duyu organı duymak yeteneğimizi için kritik öneme sahiptir. Bu destek hücreleri (SC'ler) glial gibi son derece uzmanlaşmış duyusal (HCS) mekano nakleden saç hücrelerden oluşur epiteli ve çevresindeki evler. Işitsel organlarda yapısal farklılıklara rağmen, işitsel organ gelişimini düzenleyen moleküler mekanizmalar evrimsel memeliler ve kuşların arasında muhafaza edilir ovo elektroporasyon E1 erken aşamalarında büyük ölçüde sınırlıdır -. E3. Nedeniyle E5 işitsel organ göreli geç gelişmesine, E3 geçmiş ovo elektroporasyon ile işitsel organın manipülasyonlar nedeniyle daha sonraki aşamalarda tavuk embriyo ileri gelişimine zordur. Burada sunulan yöntem de ilgi genleri hedef için geçici bir gen transferi yöntemisahne E4 – ovo mikro-elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan tavuk işitsel duyu organ E4.5. Bu yöntem, gain- ve-kaybı fonksiyonları bilinen plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uygulanabilir ve en bütün embriyoya edu (5-etinil-2'-deoksiuridin) eklenerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir elektroporasyon süresi. yeşil ya da kırmızı floresan proteininin (GFP veya RFP) ifade plazmaları kullanımı deneyci hızla elektroporasyon başarıyla gelişen iç kulağın işitme bölümünü hedef belirlemek için izin verir. Bu yöntem yazıda, GFP Electroporated örneklerin temsili örnekleri gösterilmiştir; elektroporasyon sonra 96 saat ve işitsel organ yanlısı duyusal alana GFP hedefleyen in situ hibridizasyon RNA tarafından doğrulandı – embriyolar 18 toplandı. yöntemi kağıt da CellProlif analiz etmek edu analog timidin kullanımı için optimize edilmiş bir protokol sağlardurmasýna; immüno-etiketlenmesi birleştiren edu Click kimyası eğitsel göre hücre çoğalma tahlilinin bir örneği temin edilmiştir.
Introduction
Memeli ve kuş işitsel duyu organı arasındaki morfoloji farklılıkları ve hücresel desenlendirme rağmen, moleküler faktörler ve duyusal HC geliştirmeden sorumlu yollar evrimsel 1-3 korunmuş olduğu düşünülmektedir. işitsel HCS ve çevrelerindeki SC'ler evler baziler papilla, iç kulak otocyst outpocketing olarak gelişir. Erken HC ve SC atalarıdır bir havuz otik plakod / otik fincan sinir-duyu yetkili etki alanı (NSDAP) içinde belirtilir. Kader-haritalama verileri nöronal ve duyusal soylar bağlantılı ve otik fincan antero-ventral bölgesinde bulunan ya da fareler ve tavuk 4,5 yılında otocyst NSDAP kaynaklanan olduğunu kanıtlar sunmaktadır. İlk olarak, Nöroblastlar sonunda işitsel ve vestibüler ganglionlar bölünmüş işitsel-vestibüler ganglion, nöronlar yol vermek için NSDAP dan tabakalara. Bu nöronlar beyin sapı iç kulak ve çekirdeklerin duyusal HCS innerve. th hücreleriNSDAP kalır at mekano nakleden duyusal HCS ve bunların ilişkili AVM oluşan işitsel duyu organı dahil olmak üzere çeşitli duyusal yamalar, yol düşünülmektedir.
civciv ve sıçangil hem de, işitme organı duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış ve HC farklılaşma degradeler karşı meydana gelir. Civciv, işitsel progenitör hücre döngüsü çıkış ~ E5 etrafında başlar ve tabandan tepeye doğru ilerler ve merkezden çevreye 6. Bir gün sonra, HC farklılaşma apeks başlar ve tabanına 7 ilerler. Fonksiyonel mekanizmalar karmaşık ameliyatları gerektirir diğer model sistemler uterus, embriyolar manipüle aksine ovo göreli kolaylıkla araştırılabilir olarak tavuk iç kulak gelişiminin incelenmesi birçok teknik avantajlar sağlamaktadır. Burada tarif edilen yöntem, olası Basila ilgi genleri hedef ovo mikro elektroporasyon kullananÖzellikle E4 otik vezikül r papilla alanı ön-ventral.
Ovo Elektroporasyon iyi kurulmuş ve genel olarak 8-14 kullanılan bir tekniktir. Elektroporasyon tekniği ilkesi nükleotidleri (örneğin, plazmid DNA, sentetik DNA ya da RNA oligonükleotidleri) negatif yüklü gerçeğine dayanır. DNA, ilgi konusu doku içine enjekte edilir. bir elektrik akımı doku boyunca yerleştirildiğinde, mevcut hücre duvarlarının geçici gözenekleri açılır ve negatif yüklü DNA, pozitif elektrot (anot) doğru akarken, DNA alımı için izin verir. kazanç fonksiyon-deneyleri için, ilgi konusu gen genellikle yeşil flüoresan protein (GFP) veya kırmızı flöresanlı proteindir (RFP) için uygun ekspresyon kasetleri içeren ifade plazmidleri alt klonlanır. kayıp-fonksiyon deneyleri plazmid tabanlı dominant negatif represör yapıları veya RNAi veya morfolino yapıları için c vardırommonly 15,16 kullanılır. Bazlı plazmid tipik mikroRNA (MiRNA) işlevi miRNA'lar sünger yapıları, inhibe etmek için, 17 kullanılabilir. Ovo mikro elektroporasyon yöntemi kolayca tüm embriyo edu ekleyerek ovo hücre çoğalma tahlilinde birleştirilebilir burada tarif edilen yöntem olup, işitme organı proliferasyonu ve farklılaşmasını kontrol eden molekül mekanizmalarının incelenmesi için izin verir.
elektroporasyon ve Edu eklenmesi bir gün işitsel organında hücre döngüsü çıkış başlangıcından önce olduğu otik vezikül içinde E4 gerçekleştirilir. tipik olarak 18 gerçekleştirilen bir işitsel organ Analizi – (HC farklılaşma sırasında) E5 (duyusal progenitör hücre döngüsü çıkış başlangıcı), E6 (HC farklılaşma başlangıcı) ve E7 elektroporasyon sonra 96 saat; ve daha sonra ~ E9 (HC farklılaşma sonuna) kadar. Gen transferi bu elektroporasyon yöntemi olup, ~ 4 gün yaklaşık süren geçicidir becauSE ilgili genler, genomu içine entegre değildir, ancak yöntem, Tol2-aracılı gen transferi 11 gibi genomuna entegre yeteneğine sahip yapmak için, uygun plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile kullanılmak için uygundur. Bu yöntemle sağlam GFP veya RFP ifade sürer ~ ile sinyalleri işaret solmaya, ancak işitsel organ karmaşık gelişimini incelemek için geniş bir zaman pencere sağlamak sonra kokleadaki 4 gün. Ovo gen aktarım yöntemi Bu roman ve özellikle işitme organı HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygun olan E4 olası işitsel organı, hedef sağlar. Bu çok daha genç gelişim aşamalarında 11,12 ya da in vitro baziler papilla eksplant kültürleri 18 kullanımı ile karşılaştırıldığında en elektroporasyona alternatif yöntemler, iyi bir yer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovo mikro-elektroporasyon burada anlatılan yöntem geliştirilmesi işitsel organ haline gen transferi için optimize edilmiştir. Tipik olarak, gen fonksiyonu / ifade işlemek için kullanılan plazmid DNA bazlı ekspresyon vektörleri ile uyumludur. E4 elektroporasyon zamanlaması işitsel organında HC geliştirme odaklanmak araştırmalar için en uygunudur. En kritik adımlar iğne ile çok derin gidiyor ve otik vezikül zarar vermeden otik vezikül lümenine DNA mikro-enjekte otik vezikül ön-ventral al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz ifade plazmaları ve in situ sondaları Dr. Doris K. Wu teşekkür Duyu Biyoloji görüntüleme tesisi için Johns Hopkins Üniversitesi Merkezi ve İşitme ve Denge Merkezi. Bu çalışma LE NIDCD Grant T32 DC000023 tarafından desteklenen
Materials
| Sterile 1x PBS pH 7.4 | gibco | 10010-023 |
| Fast Green FCF Powder | Sigma | F7252-5G |
| EdU Powder | Invitrogen | E10187 |
| Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit | Invitrogen | C10338 |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit (25) | Qiagen | 12643 |
| ECM 830 ElectroSquarePorator | BTX Harvard Apparatus | |
| Banana to Micrograbber Cable Kit | BTX Harvard Apparatus | 45-0216 |
| Right Handed & Left Handed Micromanipulators | World Precision Instruments Inc. | M3301R & M3301L |
| Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts | World Precision Instruments Inc. | M10 |
| Metal Steel Base Plate 12×24 inch | World Precision Instruments Inc. | 5479 |
| Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors | World Precision Instruments Inc. | 14120 |
| Micropippette Puller for pulling needles | Sutter Instrument Co. | P-97 |
| 2.5×2.5 mm Box Platinum Heating Filament | Sutter Instrument Co. | |
| Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm | FHC | 27-30-0 |
| Hamilton Glass Syringe 100 μl | Hamilton | 80601 Model 710LT |
| Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe | Fisher Scientific | O122-1 |
| Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic | Becton Dickinson and Company (BD) | 427420 Intramedic Clay Adams Brand |
| 3 cc Disposable Syringes | Becton Dickinson and Company (BD) | 309657 |
| Disposable 21 Gauge Needles | Becton Dickinson and Company (BD) | 305122 |
| One pair of 2 mm Platinum Electrodes | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY611P3-2 |
| Electrode Holder | Bulldog Bio. / Nepagene | CUY580 |
| One pair of Dumont fine forceps number 5 | Fine Science Tools (FST) | |
| Matte finish invisible tape for sealing eggs | Office Depot | 520-928 |
| Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 23-400-101 |
| Sterile filter tips |
References
- Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
- Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
- Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
- Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
- Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
- Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
- Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
- Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
- Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
- Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
- Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
- Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
- Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871 (2012).
- Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
- Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
- Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
- Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
- Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
- Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).
