Method Article

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한 비켜에서 마이크로 전기

DOI:

10.3791/53864

⸱

April 17th, 2016

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

In This Article

Summary

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청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

Abstract

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닭 배아 유전자 기능의 조작은 오보에서 비교적 용이하게 수행 될 수있는 배아 발달 공부 이상적인 모델 시스템이다. 내이의 청각 감각 기관들을 수있는 우리의 능력 중요합니다. 그것은 지원 세포 (희주) 아교와 같은 고도로 전문화 된 감각 HCS () - 기계 열 변환 유모 세포로 구성되어 상피와 주변 주택. 청각 기관의 구조적인 차이에도 불구하고, 청각 기관의 발달을 조절하는 분자 메커니즘이 진화 포유 동물과 AVES 사이에 보존되어 비켜 전기에서 E1의 초기 단계에 크게 제한된다 -. E3. 때문에 E5의 청각 기관의 상대적으로 늦게 개발, E3 과거 비켜 전기에 의한 청각 기관의 조작으로 인해 나중 단계에서 닭 배아의 고급 개발에 어렵습니다. 여기에 제시된 방법은 관심 유전자를 타겟팅하는 일시적 유전자 전달 방법단계 E4 - 비켜 마이크로 전기의를 통해 개발 치킨 청각 감각 기관에 E4.5. 이 방법은 이득 - 및 상실 함수 종래의 플라스미드 DNA 계 발현 벡터를 적용하고 상기 전체 배아 EDU (5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘)을 첨가하여 오보 세포 증식 분석에서 결합 될 수있다 전기의 시간입니다. 녹색 또는 적색 형광 단백질 (GFP 또는 RFP) 발현 플라스미드의 사용은 실험 신속 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 판단 할 수있다. 이 방법 논문에서는 GFP 전기 천공 표본의 대표적인 예는 예시; 전기 후 96 시간과 청각 기관의 프로 감각 영역에 GFP의 대상은 현장 하이브리드의 RNA에 의해 확인되었다 - 배아는 18을 수확했다. 이 방법은 종이 셀 prolif를 분석 듀 아날로그 티미 딘의 사용을 위해 최적화 된 프로토콜을 제공한다eration; 면역 라벨링을 결합 듀 화학을 클릭했을 듀 계 세포 증식 분석의 예를 제공한다.

Introduction

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포유류 및 조류 청각 감각 기관 사이의 형태 차이 및 세포 패턴에도 불구하고, 분자 요인과 감각 HC의 개발을 담당 경로는 진화 1-3 보존 될 것으로 생각된다. 청각의 HC와 그 주변으로 SC를 수용하는 기저 유두는, 내부 귀 otocyst의 outpocketing으로 개발하고 있습니다. 초기 HC 및 SC 조상의 풀은 귀의 placode / 귀 컵 신경 감각 능력 도메인 (NSD) 내에서 지정됩니다. 운명 매핑 데이터는 신경 및 감각 계통이 연결과 귀 컵의 안테 - 복부 지역에 위치한 나 마우스와 치킨 4,5에 otocyst NSD에서 발생된다는 증거를 제공. 먼저 neuroblasts 결국 청각 및 전정 신경으로 분할 청각-전정 신경절의 뉴런을 야기 할 NSD로부터 박리. 이 신경은 뇌간에있는 내이 및 핵의 감각의 HC를 신경을 분포시키다. 세포 일NSD에 남아있는 열 변환 - 기계 감각의 HC 및 연관된으로 SC 구성된 청각의 감각 기관을 포함하는 다양한 관능 패치를 야기 할 것으로 생각된다.

병아리와 쥐 모두에서, 청각 기관의 감각 전구 세포주기 출구와 HC 차별화 그라디언트 반대에서 발생합니다. 병아리 청각 전구 세포주기 종료 ~ E5 주위 시작 기저부로부터 꼭지점까지 진행하고, 중심으로부....

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Protocol

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계란과 깐 배아는 마음에 든다고 윤리적 및 인도적으로 처리됩니다. 깐 배아 사용에 대한 모든 프로토콜은 의학, 볼티모어, 메릴랜드의 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 계란과 식 구조의 제조

  1. 달걀 :
    1. 3 품어 - 4 다스 수정 된 닭고기 달걀 (갈 루스 갈 루스) 37 ° C에서 자신의 양쪽에 평평하게 누워.
      1. 배양 24 시간 후, 계란의 라운드 백 엔드에서 주사기와 알부민의 3 CC를 당겨 명확한 테이프로 구멍을 밀봉. 이 계란 (19)의 상단에 액세스를 위해 창을 절단 할 때 쉘을 고집 배아없이 배아에 대한 접근의 용이성을 허용, 배아와 껍질 사이에 공기 실을 만듭니다.
      2. 배양 시간의 117 시간에서 햄버거와 해밀턴 (20) 발달 단계에 따라 배아를 무대E4 (HH24-25)에서 (그림 1D 참조).
  2. 식 구축 :
    1. 시약을 사용하여 플라스미드 DNA와 시판 제제 키트 제조업체가 제공하는 프로토콜을 준비한다. 제제의 최종 단....

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Results

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녹색 형광 단백질로 구성된이 방법 종이 플라스미드 DNA에서 (GFP) 발현 카세트는 ~를 산출, 12 V 4 100 밀리 초 펄스 폭과 펄스와 200 밀리 초 간격의 최적화 된 매개 변수를 사용하여 개발 치킨 기저 돌기 (BP)에 대상이되었다 50 % 태아 생존율 및 BP에 타겟팅 플라스미드 DNA의 효율. (; 흰색 화살표 그림 1 EE ')와 GFP 발현 시간 걸쳐 올 수 있습니다 배아를 개발 기본 GFP 발현의 형광 이미징은 전기의이 방법은 우선적으로 BP에 상승을 제공하는 otocyst의 앞쪽-복부 측면을 대상으로했다 약 ~ 4 일까지 (그림 1 EH). 계내 혼성화 (ISH)에서 RNA는 전기 성공적 현상 내이의 청각 부를 대상 여부를 결정하는 데 사용되었다. GFP는 청각에 의해 찍은 여부를 확인하려면감각 선조는 ISH 실험 BP 인접 부에서 수행 하였다. 개발 B.......

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Discussion

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오보 마이크로 일렉트로에서의 여기에 설명 된 방법은 현상 청각 기관으로의 유전자 전달에 대해 최적화되어있다. 그것은 일반적으로 유전자 기능 / 발현을 조작하는 데 사용되는 플라스미드 DNA 계 발현 벡터와 호환된다. E4에서 전기의 타이밍은 청각 기관에서는 HC 개발에 집중 조사에 적합하다. 가장 중요한 단계는 바늘 너무 깊이 가서 귀의 소포를 손상시키지 않고 귀의 소포 루멘에 DNA를 미세 주입하는 귀의 소포의 앞쪽-복부 도메인에 의해으로 DNA를 대상으로, (그림. 1A-D 참조) 구체적 추정 청각 타겟팅 - (4- μg의 / μL ~ 3.5) 이에 따라 전극을 배치하는이 전기 매개 변수를 최적화 된 플라스미드 DNA의 농도를 최적화 12 V.에서 4 펄스의 최적화 된 전기 매개 변수 전달 (.도 1C를 참조), E4에서 기관. 처음에 우리가 시작 오유타은 형광 신호를 산출하지 6 V에서 electroporations을 실시. 전압.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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우리는 발현 플라스미드과 현장 프로브 박사 도리스 K. 우 감사, 감각 생물 이미징 시설의 존스 홉킨스 대학 센터와 청력과 균형을위한 센터. 이 작품은 LE에 NIDCD 부여 T32 DC000023에 의해 지원되었다

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
멸균 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
패스트 그린 FCF 파우더시그마F7252-5G
EdU 파우더InvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 이미징 키트InvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTX 하버드 장치
바나나-마이크로그래버 케이블 키트BTX 하버드 장치45-0216
오른손잡이 & 왼손잡이용 마이크로매니퓰레이터World Precision Instruments Inc. M3301R 및 M3301L
7인치 수직 포스트가 있는 두 개의 12mm 자기 홀딩 장치 스테이지World Precision Instruments Inc. M10
메탈 스틸 베이스 플레이트 12x24인치월드 프리시전 Instruments Inc. 5479
계란 용 가위 12cm 길이 곡선, 12mm 극세 칼날; 스프링 가위World Precision Instruments Inc. 14120
바늘을 당기기 위한 마이크로 피펫 풀러Sutter Instrument Co.P-97
2.5x2.5mm 박스 플래티넘 가열 필라멘트셔터 기기 Co.
유리 모세관 / 바늘 / 섬유 없음 / Borosil 1 mmFHC27-30-0
Hamilton 유리 주사기 100 μ lHamilton80601 모델 710LT
미네랄 오일(중) 해밀턴 유리 주사기Fisher ScientificO122-1
유리 주사기 및 유리 캡필러리 바늘 연결용 폴리에틸렌 튜브/무독성Becton Dickinson and Company (BD)427420 Intramedic Clay Adams 브랜드
3cc 일회용 주사기Becton Dickinson and Company (BD)309657
일회용 21 게이지 바늘Becton Dickinson and Company (BD)305122
2mm 백금 전극 한 쌍Bulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
전극 홀더Bulldog Bio. / NepageneCUY580
Dumont fine yplocks number 5Fine Science Tools (FST)
밀봉을 위한 무광택 마감 투명 테이프Office Depot520-928
면봉Fisher Scientific23-400-101
멸균 필터 팁
한 쌍계란

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochl....

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In Ovo ElectroporationChicken Auditory OrganMicroinjection TechniqueEdU Proliferation AssayGFP Expression PlasmidRNA In Situ HybridizationOtic Vesicle TargetingSensory Progenitor CellsHair Cell DifferentiationEmbryonic Day Four

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