קולטן autoradiography פרוטוקול עבור ויזואליזציה המרוכזת של אנגיוטנסין II רצפטורים
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר דפוסים מחייבים קולטן עבור אנגיוטנסין II (אנג II) במוח החולדה באמצעות radioligand ספציפי לקולטניים אנג השנייה לבצע מיפוי קולטן autoradiographic.
דגימות רקמות נקצרות ומאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס. Cryostat משמש סעיף coronally הרקמה (המוח) הפשרת הר בסעיפים גבי שקופיות טעונות. סעיפי הרקמות רכובי השקופיות מודגרת 125 I-SI-אנג שני radiolabel קולטנים אנג השני. שקופיות סמוכות מופרדים לשתי קבוצות: "הלא ספציפיות מחייבים" (NSP) בנוכחות ריכוז להרוות הקולטן של הלא רדיואקטיבי אנג השנייה, או AT 1 תת סוג קולטן אנג השני (AT 1 R) אנטגוניסט לרצפטור אנג שני סלקטיבית , ו 'סה"כ מחייב "ללא AT אנטגוניסט R 1. ריכוז להרוות של תת-סוג קולטן AT 2 אנג השנייה (AT 2 R) אנטגוניסט (PD123319, 10 מיקרומטר) קיים גם incubatiעל חיץ להגביל 125 I-SI-אנג השנייה מחייב את תת סוג R AT 1. במהלך 30 דקות הדגירה טרום ב ~ 22 ° C, מגלשות NSP נחשפים 10 מיקרומטר PD123319 ו Losartan, כאשר בוחרים באפשרות 'סה"כ מחייב' שקופיות נחשפים 10 מיקרומטר PD123319. שקופיות מודגרת מכן עם 125 I-SI-אנג השנייה בנוכחות PD123319 עבור 'להסתכם מחייב', ו PD123319 ו Losartan עבור NSP חיץ assay, ואחריו כמה 'שוטף' חיץ, ומים כדי להסיר מלח אי כבול radioligand במיוחד. השקופיות הן יבשות באמצעות מכת מייבשים, אז נחשפו סרט autoradiography באמצעות סרט קלטת מיוחד. הסרט הוא פיתח את התמונות נסרקים לתוך המחשב עבור צפיפות ויזואלית וכמותית באמצעות מערכת הדמיה קנייני גיליון אלקטרוני. סט נוסף של שקופיות thionin מוכתם להשוואות היסטולוגית.
היתרון של שימוש autoradiography קולטן הוא היכולת לדמייןאנג השנייה קולטנים באתרו, בתוך קטע של דגימת רקמות, אנטומית לזהות את האזור של הרקמה על ידי השוואתה קטע התייחסות היסטולוגית סמוך.
Introduction
מחלות לב וכלי דם ממשיכה להיות הגורם המוביל למוות ונכות בארצות הברית, גרימה יותר מ -30% ממקרי המוות בארצות הברית בשנת 2011 1. הנתונים הסטטיסטיים העדכניים ביותר של איגוד הלב האמריקאי עולה כי יותר מאדם אחד מכל שלוש יש אחד או יותר סוג של מחלות לב וכלי דם. מחקר לב וכלי דם ממשיך לעשות צעדים נגד להבנת המחלה הזאת, אבל כמו דורות להתחיל מזדקן זה הכרחי כדי להמשיך במאמצים אלה. מערכת רנין-אנגיוטנסין (RAS) ממלא תפקיד מרכזי בוויסות של מערכת הלב וכלי הדם בעיקר על ידי קידום טרשת עורקים, דלקת, vasoconstriction מערכתית, והפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית (איור 1) 2-8.
ראס הוא המערכת ההורמונלית, כי הוא מופעל כאשר תאים juxtaglomerular של הכליה להפריש רנין לתוך זרם הדם בתגובה וירידה בלחץ דם, גדל sympatגירוי hetic, או ירידה בזרימת נתרן ידי Densa המקולה. רנין חילוף החומרים angiotensinogen (מסונתז בכבד) כדי ליצור אנגיוטנסין I (אנג לי). אנג לי עובר מטבוליזם מכן על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין (ACE), גידול ectoenzyme בצד luminal של תאי האנדותל של כלי הדם, בעיקר הריאות והכליות, כדי ליצור אנגיוטנסין II (אנג II), הפפטיד מפעיל הראשי של RAS. אנג II הוא מסוגל הפעלת שתי תת קולטן; הקולטן מסוג 1 (AT 1 R) לבין הקולטן מסוג 2 (AT 2 R), הן המסדירות את מערכת הלב וכלי הדם, לשמור על הומאוסטזיס נוזלים ואלקטרוליטים ו נחשבים כיום להשפיע על התפקוד הקוגניטיבי ומחלות ניווניות מעבדת 8,9. RAS מקומי, מוח ספציפי מדווח באופן עצמאי לסנתז אנג שנייה. בשנת המוח, angiotensinogen חלבון מבשר הוא מסונתז astroglia 10 מומר אנג לי על ידי אנזים רנין דמוי 3, ואולי כבול prorenin לקולטן prorenin11, ולאחר מכן להמיר אנג השנייה על ידי אנזים-המרת אנגיוטנסין אשר מבוטא בשפע על פני השטח התאיים של נוירונים במוח 12. Intrabrain זה שנוצר אנג II הוא אגוניסט למוח AT 1 ו- AT 2 קולטנים מבודדים השנייה אנג שמקורן בדם.
בעוד AT 1 R ממלא תפקיד פיזיולוגי חשוב, זה ידוע יותר עבור אפקטים pathophysiological שלה בכל הגוף, המשפיעים על מערכת הלב וכלי הדם בעיקר והכליות (איור 2). כאשר אנג II נקשר R 1 AT, שהיא גורמת vasoconstriction; הגדלת התנגדות לזרימת דם והעלאת לחץ דם. זה גם מקדם סינתזה הפרשת אלדוסטרון ווסופרסין, שמוביל נתרן מוגברת החזקת מים. תופעות אלה יכולים גם לגרום נזק מוחי איסכמי וליקויים קוגניטיביים והיא צמודה מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, ואת diabetes, כמו גם להיות זיהו באחרונה להשפיע למידה וזיכרון 13-15. יש לולאת משוב בשכונת ראס באותה AT 1 R על תאי juxtaglomerular בכליות מעכב הפרשת רנין. מעניין לציין, כי R AT 2 בדרך כלל נגד מווסת את הפעולה של AT 1 R, גרימת התרחבות, תולדה neurite, התחדשות axonal, אנטי התפשטות, cerebroprotection בקרב רבים אחרים 16-20. ה- R AT 2 גם זוהה כיעד אנטי יתר לחץ דם ולאחרונה, תרופות אנטי-סרטני 21. קביעת לוקליזציה הצפיפות של קולטנים אנג השניים בתוך רקמות שונות וכיצד הם מושפעים טיפולים שונים ומצבי המחלה באמצעות autoradiography קולטן densitometric כמותית יעזור לחשוף את התפקיד RAS משחק במחלות ספציפיות.
autoradiography קולטן שימש במשך למעלה מ -30 שנה כשיטה יעילה עבור המעידים על נוכחות של אנגיוטנסין Iאני קולטנים ורכיבים אחרים של RAS במוח וברקמות אחרות של חולדה, עכבר, שרקן, הכלב האנושי תחת מגוון רחב של תנאי הניסוי 22-34. החשיבות של איתור קולטנים השני אנג בתוך המוח היא שאפשר להחיל הנוירואנטומיה פונקציונלי לפעולות של אנג השנייה במוח, למשל, הנוכחות של R AT 1 בגרעין paraventricular של ההיפותלמוס (PVN) מציעה פונקציה של אנג שני במוח כדי לעורר וזופרסין, אוקסיטוצין או שחרור הורמון קורטיקוטרופין (CRH) שחרור, או הפעלה של מערכת העצבים הסימפתטית. לכן, תרופות החוסמות את R AT 1 עשויות להקטין כמה תופעות PVN בתיווך אלה הקשורים על פעילות של RAS המוח. תוצרת בעיבוד מראה שהשימוש של AT 1 יריבי R יכול להקטין הפרעת דחק פוסט-טראומטי (PTSD) שחרור -induced של CRH ו לשפר את הסימפטומים של PTSD (Hurt et al., שהוגש לפרסום). PVN, subfornicalהאיבר (SFO), ו האמיגדלה ידוע להסדרת הומאוסטזיס, תיאבון / צמא, שינה, זיכרון, תגובות רגשיות, והם בתחומי היעד של מחקר הפגנה הזאת. אזורים אלה נבחנו על ידי איסוף חלקי עטרה של מוח על שקופיות מיקרוסקופ, וטיפול הקטעים עם מעכבים ספציפיים יחד עם radioligand ספציפי לקולטניים אנג השני. במחקר זה, כל החומרים ריאגנטים יחד עם ספקים הציעו מפורטים, יוד-125 שמשו radiolabel אנטגוניסט לקולטן אנג השנייה, sarcosine 1, isoleucine 8 אנג שני (SI אנג II), אשר היה מטוהר אז כמו שאני מוניתי 125 -SI אנג II באמצעות שיטות HPLC כפי שתואר לעיל 35. השימוש radioligand פעילות ספציפית גבוהה זה מאפשר הדמיה של תחומי צפיפות קולטני נמוך, בינוני וגבוה לאחר חשיפה של חלקים רדיואקטיבי כדי הסרט רנטגן. על ידי כיול הסרט לתקני רסק מוח המכילים לסכומים ידועים של יוד-125, הסכום המבוקששל קולטן אנג השני מחייב בשטח ניתן לכמת. במחקרים ניסיוניים, הקולטן אנג השנייה מחייב במוחם של הנבדקים הניסוי ניתן בהשוואה לזו במוחם של נבדקים בריאים. זה יכול לציין אם הפעולות של אנג שנייה הם שינו בתגובת מחלה גנטית, נורמליות פנוטיפי, מצב מחלה או טיפול תרופתי. ידע זה יכול להיות מיושם על הפיתוח של טיפולים לטיפול במחלות הקשורות חוסר ויסות של RAS. טכניקות חלופיות המזהות קולטן אתרי קישור, אבל עם רזולוציה אנטומיים מופחתת, מחייבות מבחנים המשתמשות הכנות קרום רקמות נגזרות homogenates רקמות, אשר מודגרת עם radioligand על פני טווח של ריכוזיים להעריך זיקה מחייבת radioligand כמו הקבוע דיסוציאציה (K D ) וקיבולת מחייב מקסימלי (מקסימום B) של הרקמה של עניין.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות שבור למטה לתוך 5 שיתוף גדולmponents: הכנת סעיפי רקמות עבור קולטן autoradiography; קולטן autoradiography; חשיפה לקולנוע פיתוח; היסטולוגיה; ניתוח תמונה densitometric.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתואר מזהה את להדמיה של 'הכולל' ו 'הלא ספציפי "מחייב של radioligand בסעיפים סמוכים סעיפי עטרה של מוח מכרסם שנקטף בעבר ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והוא יכול להיות ישים בקלות כמעט בכל רקמה אנטומית פתר substructures אשר להציג כמויות הפרש של קולטנים או אתרי קישור radioli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics–2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
- Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
- Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
- Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U., Ganong, W. F., Martini, L. . Frontiers in Neuroendocrinology. , 61-99 (1978).
- Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, 19-24 (1995).
- von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
- Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004 (2013).
- de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
- Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
- Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
- Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635 (2012).
- Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
- Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
- Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
- Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
- Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
- Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
- Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
- Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
- Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
- Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
- Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
- Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
- Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
- Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
- Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
- Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
- Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
- Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
- Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
- MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
- Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
- Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
- Speth, R. C., Harding, J. W., Wang, D. H. . Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. , 275-295 (2001).
- Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
- Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
- Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
- Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
- Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
- Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
- Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
- Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
- Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
- Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
- Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
- Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
- Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31 (2013).
- Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234 (2013).
- Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. 신경과학. 226, 489-509 (2012).
