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신경과학

Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर्स की स्थानीय दृश्य के लिए रिसेप्टर autoradiography प्रोटोकॉल

Published: June 07, 2016
doi:
10.3791/53866
, , ,
1Farquhar College of Arts and Sciences,Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Nova Southeastern University, 3School of Medicine,University of Colorado

Summary

Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.

Abstract

इस प्रोटोकॉल चूहे के मस्तिष्क में Angiotensin द्वितीय (आंग द्वितीय) के लिए रिसेप्टर बंधन पैटर्न एक radioligand विशिष्ट आंग द्वितीय रिसेप्टर्स रिसेप्टर autoradiographic मानचित्रण प्रदर्शन करने के लिए उपयोग कर का वर्णन है।

ऊतक नमूनों काटा और -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है। एक cryostat coronally अनुभाग के लिए ऊतक (मस्तिष्क) का इस्तेमाल किया जाता है और आरोप लगाया स्लाइड पर वर्गों पिघलना माउंट। स्लाइड पर चढ़कर ऊतक वर्गों आंग द्वितीय रिसेप्टर्स radiolabel 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय में incubated हैं। निकटस्थ स्लाइड दो सेट में विभाजित हैं: (1 में आर) पर 1 आंग द्वितीय रिसेप्टर उप प्रकार 'गैर विशिष्ट बंधन' गैर radiolabeled आंग द्वितीय की एक रिसेप्टर saturating एकाग्रता, या एक की उपस्थिति में (एनएसपी) चयनात्मक आंग द्वितीय रिसेप्टर प्रतिपक्षी और एटी 1 आर प्रतिपक्षी कोई साथ 'बाध्यकारी कुल'। के 2 आंग द्वितीय रिसेप्टर उप प्रकार (2 आर) एक saturating एकाग्रता प्रतिपक्षी (PD123319, 10 माइक्रोन) के भी incubati में मौजूद हैबफर पर 125 मैं-एसआई आंग II में 1 आर उप प्रकार के लिए बाध्य सीमा। ~ 22 डिग्री सेल्सियस, एनएसपी स्लाइड 10 माइक्रोन PD123319 और losartan को उजागर कर रहे हैं पर एक 30 मिनट पूर्व ऊष्मायन के दौरान, जबकि 'बाध्यकारी कुल' स्लाइड 10 माइक्रोन PD123319 के संपर्क में हैं। स्लाइड्स तो बफर में PD123319 की उपस्थिति 'बाध्यकारी कुल' के लिए 125 मैं-एसआई आंग द्वितीय के साथ incubated रहे हैं, और परख बफर में PD123319 और एनएसपी के लिए losartan, कई 'washes' द्वारा पीछा किया, और नमक और गैर दूर करने के लिए पानी विशेष रूप से radioligand बंधे। स्लाइड एक विशेष फिल्म और कैसेट का उपयोग झटका dryers, तो autoradiography फिल्म के संपर्क में उपयोग करते हुए सूख रहे हैं। फिल्म विकसित की है और छवियों दृश्य और मात्रात्मक डेन्टिसिटोमीटरी एक मालिकाना इमेजिंग प्रणाली और एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर के लिए एक कंप्यूटर में स्कैन कर रहे हैं। स्लाइड का एक अतिरिक्त सेट ऊतकीय तुलना के लिए thionin-दाग रहे हैं।

रिसेप्टर autoradiography उपयोग कर के लाभ कल्पना करने की क्षमता हैआंग बगल में द्वितीय रिसेप्टर्स, एक ऊतक नमूना के एक वर्ग के भीतर, और संरचनात्मक रूप से एक बगल ऊतकीय संदर्भ अनुभाग के लिए तुलना करके ऊतक के क्षेत्र की पहचान।

Introduction

हृदय रोग 2011 1 में संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत और विकलांगता, अमेरिका में होने वाली मौतों के 30% से अधिक के कारण का प्रमुख कारण बना हुआ है। अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन से अंतिम आंकड़ों से संकेत मिलता है कि तीन में एक से अधिक व्यक्ति एक है हृदय रोग की या एक से अधिक प्रकार के। हृदय अनुसंधान इस रोग को समझने के खिलाफ प्रगति कर रहा है, लेकिन के रूप में पीढ़ियों पुराने हो रही शुरू यह इन प्रयासों को जारी रखने के लिए आवश्यक है। रेनिन-एंजियोटेनसिन प्रणाली (रास) मुख्य रूप से atherosclerosis, सूजन, प्रणालीगत वाहिकासंकीर्णन, और सक्रियण सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की चित्रा (1) 2-8 बढ़ावा देने के द्वारा हृदय प्रणाली के नियमन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है।

आरएएस एक हार्मोनल प्रणाली है कि जब गुर्दे की कोशिकाओं स्तवकासन्न खून में रेनिन छिपाना जवाब में रक्तचाप कम करने के लिए सक्रिय है, sympat वृद्धि हुईhetic उत्तेजना, या मैक्युला densa द्वारा सोडियम प्रवाह में कमी आई है। रेनिन angiotensinogen (जिगर में संश्लेषित) एंजियोटेनसिन मैं (आंग मैं) के रूप में metabolizes। आंग मैं तो मुख्य रूप से फेफड़े और गुर्दे में, संवहनी endothelial कोशिकाओं की ल्यूमिनल तरफ एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम (ऐस) द्वारा metabolized है, एक ectoenzyme, एंजियोटेनसिन द्वितीय (आंग द्वितीय), आरएएस की मुख्य प्रेरक पेप्टाइड के रूप में। आंग द्वितीय दो रिसेप्टर उपप्रकार को सक्रिय करने के लिए सक्षम है; टाइप 1 रिसेप्टर (1 एटी आर) और टाइप 2 रिसेप्टर (2 आर), जो दोनों के हृदय प्रणाली को विनियमित करने, तरल पदार्थ और इलेक्ट्रोलाइट homeostasis को बनाए रखने और अब संज्ञानात्मक समारोह और neurodegenerative रोग को प्रभावित करने के लिए विचार कर रहे हैं 8,9 प्रक्रियाओं। एक स्थानीय, मस्तिष्क विशिष्ट रास स्वतंत्र रूप से आंग द्वितीय के संश्लेषण के लिए सूचना दी है। मस्तिष्क में, अग्रदूत साबित प्रोटीन angiotensinogen अस्थिकणिका 10 एक रेनिन-तरह के एंजाइम 3 से आंग मैं करने के लिए परिवर्तित में संश्लेषित है, संभवतः prorenin prorenin रिसेप्टर के लिए बाध्य11, और बाद में एंजियोटेनसिन परिवर्तित एंजाइम जो बहुतायत से मस्तिष्क 12 में न्यूरॉन्स की बाह्य सतह पर व्यक्त की है द्वारा आंग द्वितीय को बदल दिया। उत्पन्न आंग द्वितीय यह intrabrain 1 में मस्तिष्क के लिए और 2 रिसेप्टर्स कि रक्त जनित आंग द्वितीय से अलग कर रहे हैं पर एगोनिस्ट है।

एटी 1 आर एक महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका निभाता है, यह बेहतर पूरे शरीर में इसकी pathophysiological प्रभाव के लिए जाना जाता है, मुख्य रूप से हृदय प्रणाली और गुर्दे (चित्रा 2) को प्रभावित। आंग II में 1 आर को बांधता है, यह वाहिकासंकीर्णन का कारण बनता है; बढ़ती रक्त के प्रवाह के लिए प्रतिरोध और रक्तचाप बढ़ गई है। यह भी, संश्लेषण और एल्डोस्टेरोन और वैसोप्रेसिन के स्राव को बढ़ावा देता है वृद्धि हुई सोडियम और पानी की अवधारण के लिए अग्रणी। इन प्रभावों को भी इस्कीमिक मस्तिष्क क्षति और संज्ञानात्मक क्षति पैदा कर सकते हैं और पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग से जुड़ा हुआ है, और Diabeटीईएस, साथ ही हाल ही में पहचान की जा रही सीखने और स्मृति 13-15 को प्रभावित करने के लिए। उस में आरएएस में एक राय पाश में गुर्दे में स्तवकासन्न कोशिकाओं पर 1 आर रेनिन स्राव को रोकता है। दिलचस्प है, में 2 आर आम तौर पर 1 आर, कई अन्य लोगों के बीच 16-20 वैसोडायलेटेशन, neurite परिणाम, axonal उत्थान, विरोधी प्रसार, और cerebroprotection पैदा की कार्रवाई जवाबी नियंत्रित करता है। 2 आर भी विरोधी उच्च रक्तचाप और हाल ही में, कैंसर रोधी दवाओं 21 के लिए एक लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है। विभिन्न ऊतकों के भीतर स्थानीयकरण और आंग द्वितीय रिसेप्टर्स के घनत्व का निर्धारण और कैसे वे विभिन्न उपचार और रोग राज्यों मात्रात्मक densitometric रिसेप्टर autoradiography का उपयोग कर भूमिका रास विशिष्ट रोगों में खेलता को उजागर करने में मदद करेगा से प्रभावित कर रहे हैं।

रिसेप्टर autoradiography एंजियोटेनसिन मैं की उपस्थिति का संकेत के लिए एक प्रभावी तरीके के रूप में 30 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया हैमैं रिसेप्टर्स और मस्तिष्क में रास के अन्य घटकों और चूहे, माउस, गिनी पिग, कुत्ते और प्रयोगात्मक शर्तों 22-34 की एक किस्म के तहत मानव के अन्य ऊतकों। मस्तिष्क के भीतर आंग द्वितीय रिसेप्टर्स लगाने का महत्व यह है कि एक मस्तिष्क में आंग द्वितीय की कार्रवाई करने के लिए कार्यात्मक neuroanatomy आवेदन कर सकते हैं, जैसे, हाइपोथैलेमस (PVN) की paraventricular नाभिक में से 1 आर की उपस्थिति आंग के एक समारोह का सुझाव मस्तिष्क में द्वितीय वैसोप्रेसिन, ऑक्सीटोसिन या corticotropin रिहा हार्मोन (CRH) रिलीज, या सहानुभूति तंत्रिका तंत्र की सक्रियता को प्रोत्साहित करने के लिए। इस प्रकार, दवाओं है कि ब्लॉक में 1 आर इन PVN की मध्यस्थता मस्तिष्क आरएएस की गतिविधि से अधिक के साथ जुड़े प्रभाव के कुछ कम हो सकता है। प्रगति में काम चलता है कि कम 1 आर विरोधी के उपयोग के बाद अभिघातजन्य तनाव विकार (पीटीएसडी) सीआरएच की रिहाई प्रेरित कम होती है और PTSD के लक्षण उन्नति कर सकते हैं (चोट एट अल।, प्रकाशन के लिए प्रस्तुत)। PVN, subfornicalअंग (एसएफओ), और प्रमस्तिष्कखंड homeostasis, भूख / प्यास, नींद, स्मृति, भावनात्मक प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने के लिए जाना जाता है, और इस प्रदर्शन के अध्ययन का लक्ष्य क्षेत्रों रहे हैं। इन क्षेत्रों में खुर्दबीन स्लाइड पर एक मस्तिष्क के राज्याभिषेक वर्गों का संग्रह है, और आंग द्वितीय रिसेप्टर्स के लिए एक विशिष्ट radioligand के साथ-साथ विशिष्ट अवरोधकों के साथ वर्गों के इलाज से जांच की गई। इस अध्ययन में, सभी सामग्री और अभिकर्मकों सुझाव विक्रेताओं के साथ साथ कर रहे हैं सूचीबद्ध, आयोडीन -125 एक आंग द्वितीय रिसेप्टर प्रतिपक्षी, sarcosine 1, isoleucine 8 आंग द्वितीय (एसआई आंग द्वितीय) है, जो तब मोनो 125 मैं के रूप में शुद्ध किया गया था radiolabel करने के लिए इस्तेमाल किया गया था -si आंग द्वितीय के रूप में पहले 35 में वर्णित एचपीएलसी तरीकों का उपयोग कर। इस उच्च विशिष्ट गतिविधि radioligand के उपयोग के एक्स-रे फिल्म के लिए radiolabeled वर्गों के प्रदर्शन के बाद, कम, मध्यम और उच्च घनत्व रिसेप्टर के क्षेत्रों के दृश्य के लिए अनुमति देता है। मस्तिष्क पेस्ट आयोडीन -125, विशेष राशि के ज्ञात मात्रा युक्त मानकों के साथ फिल्म औजार द्वाराएक क्षेत्र में बाध्यकारी आंग द्वितीय रिसेप्टर की मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। प्रयोगात्मक अध्ययन में, प्रायोगिक विषयों के दिमाग में बाध्यकारी आंग द्वितीय रिसेप्टर कि नियंत्रण विषयों के दिमाग में तुलना की जा सकती। यह संकेत मिलता है कि क्या कर सकते हैं आंग द्वितीय की कार्रवाई एक आनुवंशिक हालत, प्ररूपी विषमता, रोग राज्य या नशीली दवाओं के उपचार के जवाब में बदल रहे हैं। यह ज्ञान तो उपचारों रास का अनियंत्रण के साथ जुड़े रोगों के इलाज के लिए के विकास के लिए लागू किया जा सकता है। वैकल्पिक तकनीकों है कि बाध्यकारी साइटों रिसेप्टर की पहचान है, लेकिन कम शारीरिक संकल्प के साथ, assays कि ऊतक झिल्ली ऊतक homogenates, जो सांद्रता हदबंदी निरंतर रूप radioligand बंधन आत्मीयता का आकलन करने की एक सीमा से अधिक radioligand के साथ incubated हैं से निकाली गई तैयारियों का उपयोग (कश्मीर डी बाध्यकारी हैं ) और अधिक से अधिक बाध्यकारी क्षमता (बी अधिकतम) ब्याज के ऊतकों की।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल 5 प्रमुख सह में नीचे टूट सकता हैmponents: रिसेप्टर autoradiography के लिए ऊतक वर्गों तैयारी; रिसेप्टर autoradiography; फिल्म प्रदर्शन और विकास; प्रोटोकॉल; और densitometric छवि विश्लेषण।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं इस अध्ययन के लिए बाहर ले देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड के साथ समझौते में नोवा दक्षिण विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया, 8 वें…

Representative Results

रेनिन-एंजियोटेनसिन प्रणाली की चयापचय मार्ग का अवलोकन चित्रा 1 और Angiotensin द्वितीय रिसेप्टर उपप्रकार पर सीधे ध्यान (1 आर और 2 में आर) चित्रा 2 में वर्णित में दिखाया गया है। 3…

Discussion

प्रोटोकॉल वर्णित 'कुल' और 'गैर विशिष्ट' एक कृंतक मस्तिष्क पहले से काटा और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत का राज्याभिषेक वर्गों के आसन्न वर्गों में radioligand के बंधन के दृश्य दिखाता है, और लगभग हर ऊतकों क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH Grant HL-113905

Materials

500ml Plastic Beakers Fisher 02-591-30
24mm x 60mm Coverslips Fisher 22-050-25
Autoradiography Imaging Film 24x30cm Carestream-Biomax MR Film 891-2560
Bacitracin (from Bacillus licheniformis) Sigma B-0125
Cardboard Sheet 8×11 Crescent Illustration Board #201 201
Coplin Jars Fisher Scientific E94
Commercial hair dryers Conair Model SD6X
Disposable Culture Tubes Fisher 14-961-26
EDTA (Disodium salt, Dihydrate) USB Corporation 15-699
Ethanol Fisher 16-100-210 
Formulary Substitute for D-19 Developer Photographers Formulary, Inc.  01-0036
Glacial Acetic Acid Fisher A38 SI-212
Histoprep / OCT Fisher SH75-125D
Film Fixer Kodak 5160320
Photo flo Kodak 1464502
Losartan Fisher/Tocris 37-985-0
MCID™ Core 7.0 MCID N/A
NaCl Fisher S271
Peel-A-Way slide grips VWR 48440-003
Permount Fisher SP15-100
PD123319 Fisher 13-615-0
Premium Charged Slides , Fine Ground Edge Premiere Microscope Slides 9308W
125I Ligands Perkin Elmer NEX- 248
125SI-Ang II  George Washington University Radioiodinated by Dr. Speth
Slide Mailers Fisher Scientific HS15986
Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) Fisher RDCS0750500
Sodium Acetate (Anhydrous) Fisher BP333-500
Thionin  Fisher T409-25
X-Ray Casette (10 x 12) Spectronics Corporation Four Square
Xylene Fisher  X3P-1GAL
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References

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Linares, A., Couling, L. E., Carrera, E. J., Speth, R. C. Receptor Autoradiography Protocol for the Localized Visualization of Angiotensin II Receptors. J. Vis. Exp. (112), e53866, doi:10.3791/53866 (2016).
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