Protocolo La autorradiografía de receptores para la visualización localizada de Receptores de la Angiotensina II
Summary
Here we present a protocol to describe the localization of angiotensin II Type 1 receptors in the rat brain by quantitative, densitometric, in vitro receptor autoradiography using an iodine-125 labeled analog of angiotensin II.
Abstract
Este protocolo describe los patrones de unión al receptor de la angiotensina II (Ang II) en el cerebro de rata usando un radioligando específico para los receptores de Ang II para llevar a cabo el mapeo receptor autorradiográfica.
Las muestras de tejido se cosechan y se almacenaron a -80 ° C. Un criostato se utiliza para la sección coronal del tejido (cerebro) y el deshielo de montaje en las secciones sobre portaobjetos cargados. Las secciones de tejido de diapositivas montadas se incuban en 125 I-SI-Ang II a marcar radiactivamente los receptores de Ang II. Diapositivas adyacentes están separadas en dos conjuntos: "unión no específica '(NSP) en presencia de una concentración de saturación del receptor de no radiomarcado Ang II, o un AT 1 subtipo de receptor de Ang II (AT 1 R) antagonista selectivo del receptor de Ang II y 'unión total' sin AT 1 R antagonista. Una concentración de saturación de AT 2 subtipo de receptor de Ang II (AT 2 R) antagonista (PD123319, 10 M) también está presente en la incubatien tampón de limitar 125I-SI-Ang unión a la AT 1 R subtipo II. Durante un 30 min pre-incubación a ~ 22 ° C, las diapositivas de NSP están expuestos a 10 M PD123319 y losartan, mientras que "la unión total 'portaobjetos se expusieron a 10 mM PD123319. Los portaobjetos se incubaron después con 125 I-SI-Ang II en presencia de PD123319 de 'la unión total', y PD123319 y losartán para NSP en tampón de ensayo, seguido por varios lavados '' en tampón, y agua para eliminar la sal y la no radioligando específicamente unido. Los portaobjetos se secan con secadores, luego se expuso a una película de autorradiografía usando una película especializado y casete. La película se desarrolla y las imágenes se escanea en un ordenador para densitometría visual y cuantitativa usando un sistema de imagen propia y una hoja de cálculo. Un conjunto adicional de diapositivas están teñidas con tionina para las comparaciones histológicos.
La ventaja de utilizar autorradiografía del receptor es la capacidad de visualizarAng II receptores in situ, dentro de una sección de una muestra de tejido, y anatómicamente identificar la región del tejido comparándola con una sección de referencia histológico adyacente.
Introduction
La enfermedad cardiovascular sigue siendo la principal causa de muerte y discapacidad en los Estados Unidos, causando más de un 30% de las muertes en los EE.UU. en 2011 1. Las estadísticas más recientes de la American Heart Association indican que más de una de cada tres personas tiene uno o más tipo de enfermedad cardiovascular. la investigación cardiovascular sigue haciendo avances contra la comprensión de esta enfermedad, pero a medida que las generaciones comienzan envejecer es imprescindible para continuar estos esfuerzos. El sistema renina-angiotensina (RAS) desempeña un papel central en la regulación del sistema cardiovascular principalmente mediante la promoción de la aterosclerosis, la inflamación, la vasoconstricción sistémica y la activación del sistema nervioso simpático (Figura 1) 2-8.
El RAS es un sistema hormonal que se activa cuando las células yuxtaglomerulares del riñón secretan renina en el torrente sanguíneo en respuesta a la disminución de la presión arterial, aumento de sympatestimulación hetic o disminución del flujo de sodio por la mácula densa. La renina metaboliza angiotensinógeno (sintetizado en el hígado) para formar la angiotensina I (Ang I). a continuación, Ang I es metabolizada por la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un ectoenzyme en el lado luminal de las células endoteliales vasculares, principalmente en los pulmones y riñones, para formar angiotensina II (Ang II), el principal péptido efector de la RAS. Ang II es capaz de activar dos subtipos de receptores; el receptor de tipo 1 (AT 1 R) y el receptor de tipo 2 (AT 2 R), tanto que regulan el sistema cardiovascular, mantener la homeostasis de líquidos y electrolitos y ahora se consideran para afectar la función cognitiva y enfermedades neurodegenerativas procesos de 8,9. A RAS local específica del cerebro se informó de sintetizar de forma independiente Ang II. En el cerebro, el angiotensinógeno proteína precursora se sintetiza en astroglia 10 convertido a Ang I por una enzima 3 renina-como, posiblemente prorrenina unido al receptor prorrenina11, y posteriormente convertida a Ang II por la enzima convertidora de la angiotensina que se expresa abundantemente en la superficie extracelular de las neuronas en el cerebro 12. Este intrabrain generada Ang II es el agonista para el cerebro AT1 y 2 receptores que están aislados de transmisión sanguínea Ang II.
Mientras que el AT 1 R juega un papel fisiológico importante, es mejor conocida por sus efectos fisiopatológicos en todo el cuerpo, que afecta principalmente al sistema cardiovascular y los riñones (Figura 2). Cuando Ang II se une a la AT 1 R, que causa vasoconstricción; aumento de la resistencia al flujo de la sangre y el aumento de la presión arterial. También promueve la síntesis y secreción de aldosterona y vasopresina, lo que aumenta la retención de sodio y agua. Estos efectos también pueden inducir daño cerebral isquémico y deterioros cognitivos y está relacionado con la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y Diabetes, además de ser identificado recientemente a afectar el aprendizaje y la memoria 13 a 15. Hay un bucle de retroalimentación en el RAS en que AT 1 R sobre las células yuxtaglomerulares en el riñón inhibe la secreción de renina. Curiosamente, el AT 2 R generalmente contra-regula la acción de AT 1 R, causando vasodilatación, el crecimiento de neuritas, la regeneración axonal, anti-proliferación, y cerebroprotection entre muchos otros 16-20. El AT 2 R también ha sido identificado como un objetivo para anti-hipertensión y recientemente, fármacos contra el cáncer 21. La determinación de la localización y la densidad de los receptores de Ang II en diversos tejidos y la forma en que se ven afectados por diversos tratamientos y estados de enfermedad utilizando autorradiografía cuantitativa del receptor densitométrico ayudará a descubrir el papel del SRA juega en enfermedades específicas.
autorradiografía del receptor se ha utilizado durante más de 30 años como un método eficaz para indicar la presencia de angiotensina II receptores y otros componentes de las RAS en el cerebro y otros tejidos de la rata, ratón, cobaya, perro y humano bajo una variedad de condiciones experimentales 22-34. La importancia de la localización de los receptores de Ang II dentro del cerebro es que se puede aplicar la neuroanatomía funcional a las acciones de Ang II en el cerebro, por ejemplo, la presencia de AT 1 R en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) sugiere una función de Ang II en el cerebro para estimular la vasopresina, oxitocina o la liberación de la hormona liberadora de corticotropina (CRH), o la activación del sistema nervioso simpático. Por lo tanto, los fármacos que bloquean el AT 1 R podrían disminuir algunos de estos efectos mediados por PVN asociados con respecto a la actividad de los RAS cerebrales. Trabajo en curso sugiere que el uso de antagonistas AT 1 R puede disminuir postraumático Trastorno de estrés (TEPT) inducida por la liberación de CRH y mejorar los síntomas de trastorno de estrés postraumático (Hurt et al., Presentado para su publicación). El PVN, subfornicalórgano (OFS), y la amígdala son conocidos por regulación de la homeostasis, el apetito / sed, sueño, la memoria, las reacciones emocionales, y son las áreas objetivo de este estudio de demostración. Estas regiones se examinaron mediante la recopilación de secciones coronales de un cerebro en portaobjetos de microscopio, y el tratamiento de las secciones con inhibidores específicos junto con un radioligando específico para los receptores de Ang II. En este estudio, todos los materiales y reactivos, junto con los vendedores sugeridas están en la lista, yodo-125 se usó para radiomarcar un antagonista de Ang II receptor, sarcosina 1, isoleucina 8 Ang II (SI Ang II), que luego se purificó como el mono 125 I -SI Ang II usando métodos de HPLC como se describió anteriormente 35. El uso de esta alta actividad específica de radioligando permite la visualización de áreas de densidad baja, moderada y alta receptor después de la exposición de las secciones radiomarcados a película de rayos x. Al calibrar la película con las normas de pasta cerebrales que contienen cantidades conocidas de yodo-125, la cantidad específicade la unión en un área de receptores de angiotensina II puede ser cuantificado. En estudios experimentales, la unión en los cerebros de sujetos experimentales receptor de Ang II puede ser comparada a la de los cerebros de los sujetos control. Esto puede indicar si las acciones de Ang II se alteran en respuesta a una condición genética, anormalidad fenotípica, estado de la enfermedad o el tratamiento de drogas. Este conocimiento puede ser aplicado al desarrollo de terapias para tratar enfermedades asociadas con la desregulación de la RAS. Las técnicas alternativas que identifican los sitios de unión al receptor, pero con reducida resolución anatómica, son ensayos que utilizan preparaciones de membrana de tejido derivados de homogeneizados de tejido, que son incubados con el radioligando en un intervalo de concentraciones para evaluar la afinidad de unión de radioligando como la constante de disociación (K D vinculantes ) y capacidad de unión máxima (Bmax) del tejido de interés.
El protocolo descrito aquí puede ser dividido en 5 grandes components: Preparación de secciones de tejido de los receptores de autorradiografía; La autorradiografía del receptor; Exposición de la película y el Desarrollo; Histología; y Análisis de Imágenes densitométrico.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito identifica la visualización de "total" y "no específica" de unión del radioligando en las secciones adyacentes de las secciones coronal de un cerebro de roedores previamente cosechado y almacenado a -80 ° C, y puede ser fácilmente aplicable a prácticamente todos los tejidos que ha resuelto anatómicamente subestructuras que muestran cantidades diferenciales de los receptores o sitios de unión de radioligando. Los procedimientos descritos en el protocolo son simples y el a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grant HL-113905
Materials
| 500ml Plastic Beakers | Fisher | 02-591-30 | |
| 24mm x 60mm Coverslips | Fisher | 22-050-25 | |
| Autoradiography Imaging Film 24x30cm | Carestream-Biomax MR Film | 891-2560 | |
| Bacitracin (from Bacillus licheniformis) | Sigma | B-0125 | |
| Cardboard Sheet 8×11 | Crescent Illustration Board #201 | 201 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | E94 | |
| Commercial hair dryers | Conair | Model SD6X | |
| Disposable Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
| EDTA (Disodium salt, Dihydrate) | USB Corporation | 15-699 | |
| Ethanol | Fisher | 16-100-210 | |
| Formulary Substitute for D-19 Developer | Photographers Formulary, Inc. | 01-0036 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38 SI-212 | |
| Histoprep / OCT | Fisher | SH75-125D | |
| Film Fixer | Kodak | 5160320 | |
| Photo flo | Kodak | 1464502 | |
| Losartan | Fisher/Tocris | 37-985-0 | |
| MCID™ Core 7.0 | MCID | N/A | |
| NaCl | Fisher | S271 | |
| Peel-A-Way slide grips | VWR | 48440-003 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| PD123319 | Fisher | 13-615-0 | |
| Premium Charged Slides , Fine Ground Edge | Premiere Microscope Slides | 9308W | |
| 125I Ligands | Perkin Elmer | NEX- 248 | |
| 125SI-Ang II | George Washington University | Radioiodinated by Dr. Speth | |
| Slide Mailers | Fisher Scientific | HS15986 | |
| Sodium Dibasic Phosphate Anhydrous (Na2PO4) | Fisher | RDCS0750500 | |
| Sodium Acetate (Anhydrous) | Fisher | BP333-500 | |
| Thionin | Fisher | T409-25 | |
| X-Ray Casette (10 x 12) | Spectronics Corporation | Four Square | |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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