Mouse ultrasonic vocalizations are used as proxies to model the genetic bases of vocal communication deficits in mouse models for neuropsychiatric disorders. The present protocol describes three experimental contexts that reliably elicit ultrasonic vocalizations from pups (throughout development) and adult mice (same-sex interactions, male-estrus female interactions).
Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies for modeling the genetic bases of vocal communication deficits. Characterizing the vocal behavior of mouse models carrying mutations in genes associated with neuropsychiatric disorders such as autism spectrum disorders will help to understand the mechanisms leading to social communication deficits. We provide here protocols to reliably elicit ultrasonic vocalizations in pups and in adult mice. This standardization will help reduce inter-study variability due to the experimental settings. Pup isolation calls are recorded throughout development from individual pups isolated from dam and littermates. In adulthood, vocalizations are recorded during same-sex interactions (without a sexual component) by exposing socially motivated males or females to an unknown same-sex conspecific. We also provide a protocol to record vocalizations from adult males exposed to an estrus female. In this context, there is a sexual component in the interaction. These protocols are established to elicit a large amount of ultrasonic vocalizations in laboratory mice. However, we point out the important inter-individual variability in the vocal behavior of mice, which should be taken into account by recording a minimal number of individuals (at least 12 in each condition). These recordings of ultrasonic vocalizations are used to evaluate the call rate, the vocal repertoire and the acoustic structure of the calls. Data are combined with the analysis of synchronous video recordings to provide a more complete view on social communication in mice. These protocols are used to characterize the vocal communication deficits in mice lacking ProSAP1/Shank2, a gene associated with autism spectrum disorders. More ultrasonic vocalizations recordings can also be found on the mouseTube database, developed to favor the exchange of such data.
신경 정신 장애 환자는 일반적으로 사회적 의사 소통의 적자를 표시합니다 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애, 정신 분열증, 또는 알츠하이머 질환 환자) 1. 유전자 변형 마우스는 더 빈번하게 설계되어 이들 두 질환의 유전 적 원인을 모델링하는데 사용. 이 마우스 모델에서 사회적 커뮤니케이션을 공부하는 것은 전형적인 사회적 기능 장애로 이어지는 유전 적 돌연변이의 메커니즘을 이해하기위한 새로운 치료법을 테스트하기 위해 높은 관심이다. 마우스는 사회적 동물이며, 후각, 촉각, 시각 및 음향 신호를 사용하여 각 다른 사람들과 의사 소통을하기 때문에, 사회적 의사 소통을 평가하기에 적합한 모델입니다.
마우스의 초음파 발성 지금 현재 가장 최근의 연구는 argu 경우에도 음성 통신 적자 3,4 (하지만 여전히 5,6 논의되는이 종 보컬 학습의 존재의 유전 적 기초를 모델링하기위한 프록시로 사용보컬 학습 7)의 부재에 대한 전자. 실험실 마우스 (참조 검토 8) 동성 사회적 상호 작용에서, 남성 – 여성의 사회 – 성적 상호 작용, 어머니 – 유아 관계에서 초음파 발성을 방출하는 것으로 밝혀졌다 청소년 – 청소년의 사회적 상호 작용 9인치 댐과 한배 새끼 (10)로부터 분리 할 때 마우스 새끼는 삶의 처음 두 주 동안 격리 통화를 방출한다. 남성은 때 11, 12 (그녀의 나 소변 큐)는 발정 여성의 존재에 초음파 발성을 방출한다. 동성 (13, 14)의 알 수없는 conspecific와 상호 작용할 때 남성과 여성은 초음파 발성을 방출한다. 조직 이러한 발성의 기능이 완전히 명확하지 않다 추가 조사가 필요합니다. 기능 측면에서 현재의 지식은 강아지 격리 전화, 성인 남성 vocalizat 방향으로 성인 여성의 근접의 촉진을 듣고 어머니의 검색 행동의 추출로 제한됩니다이온 (15)와 성인 여성 발성 (16)를 듣고 성인 남성의 증가 탐색 적 행동.
신경 정신 질환의 마우스 모델에서 음성 통신에 이상을 특성화하는 실험 조건에 큰 기여를 배제하기 위해 표준화 된 조건에서 수행되어야한다. 동시에 사회적 상호 작용 및 다양한 유전자 모델에서 신경 생물학적 연구의 평가와 함께 이러한 특성화는 마우스 초음파 통신의 다양한 측면에 대한 유전 적 기여에 대한 우리의 지식을 개선해야한다. 장기간에 걸쳐, 그것은 인간의 사회적 의사 소통의 일부 신경 생물학적 기초에 더 빛을 제공해야합니다. 우리는 현재 안정적으로 개발 과정 및 실험실에서 두 남성과 여성의 마우스에 대한 성인에서 초음파 발성을 유도하는 간단한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로하고 있습니다. 이러한 프로토콜은보다 확실하게 ultr을 비교하는 기록의 표준화를 완화한다균주 및 연구소 간의 asonic 발성 배출. 또한 마우스의 초음파 발성 녹음에 대한 사전 경험이없는 실험실에서 같은 기록의 설정까지를 용이하게한다. 또한 사회적 장애뿐 아니라 초음파 발성의 발광의 상황에 중요한 정보를 얻을 수 성인 마우스 사회적 상호 작용 동안 동시에 수집 상세한 행동 데이터와 초음파 발성 데이터를 결합하는 전류 가능성을 강조. 이러한 분석은 조직과 마우스의 초음파 발성의 기능을 새롭게 조명한다. 마지막으로, 우리는 또한 mouseTube 데이터베이스 (http://mousetube.pasteur.fr)에 전체 과학계와 초음파 발성 기록을 공유 할 수있는 가능성을 광고한다. 오디오 데이터를 기록하는 오픈 액세스 과학자 다른 라보 기록 초음파 발성으로 자신의 데이터를 비교할 수 있도록함으로써 마우스 초음파 커뮤니케이션 기술을 향상한다(유사하거나 상이한 균주 / 프로토콜) ratories, 및 / 또는 다른 조건에서 기록 된 파일을 자신의 분석 방법에 도전합니다.
여기에 제시된 프로토콜은 실험실에서 마우스 초음파 발성를 수집하는 표준화하고 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이들은 매우 제한된 상황 표준화의 이점을 제시한다. 그들은 균주 18,19,26,27 내 균주 또는 유전자형을 비교하는 데 성공 사용된다. 대표 결과에서 제시된 바와 같이, 이러한 방법은 Shank2, 자폐증 스펙트럼 장애와 관련된 유전자 돌연변이 생쥐의 전형적인 사회적 의사 소통의 식별을 할 수 있습니다. 실험실 다른 컨텍스트 사이 또는 사이에 마우스 변종 사이의 비교는 mouseTube 데이터베이스에 더 큰 데이터 세트의 가용성에 의해 트리거됩니다. 이 도구는 다변량 분석을 허용하여 마우스의 초음파 발성에 대한 연구를 강화해야한다.
이 유전자 C 모델링 대부분의 연구에서 수행 된 바와 같이 여기에 설명 된 프로토콜은 변형 내의 다른 유전자형 생쥐를 테스트하기 위해 최적화신경 정신 질환에 ontribution. 이는 실험적으로 최상의 컨트롤이 각 연구를 설계하는 것이 좋습니다. 사실, 쓰레기 효과는 마스크 또는 인위적으로 유전 적 영향 (28, 29)을 팽창 수 있습니다. 각각의 유전자형에 대한 한배의 새끼 컨트롤을 포함하는 것이 바람직하다. 그것은 쓰레기에서 돌연변이 및 제어 마우스의 정확한 일치를 허용하기 때문에 사육 이형 부모는 따라서 선호한다. 이 매 2 일 녹음을 통해 개인을 추적하는 (유전자형에 눈을 멀게) 모든 강아지의 마킹 발 문신을 정당화. 유전자형은 꼬리 샘플을 채취하여 이유에서 이루어집니다. P2에서 강아지 격리 전화에 기록 할 때, 우리는이 작업이 추가 조작 및 녹음 세션에 시간에 아주 가까이 스트레스를 포함하기 때문에, 새끼 이미 꼬리 샘플을 채취 권하고 싶지 않다.
여기에 제안 된 프로토콜은 EMI의 명확한 식별을 허용하지 않는 성인에서 초음파 발성을 유도합니다발성의 라 자세 히. 우리가 실험 동물의 의욕을 조작하는 이유에 대해 설명합니다. 실제로 테스트 마우스 고립되어 아닌 새로운 코너 및 시험 동물 동성 상호 작용하는 동안 테스트 케이지에 오랫동안 길들. 암수 상호 작용에서, 도입 여성 격리되지 않고, 시험 남성 동기 성이 문맥에서 더 높을 수 있으므로 짧은 시간 habituates. 동기 이러한 조작은 발성되지 도입 한 발광 시험 마우스의 확률을 최대화한다. 성적인 맥락에서 남성 초음파 발성을 기록하기 위해, 발정 여성의 신선한 (즉, 냉동하지 않음) 소변으로 간단한 면봉도 케이지 (30)에 도입 될 수있다. 이 방법은 100 % 확실성 테스트 남성 초음파 발성의 할당을 허용하지만, 이들 발성 방출 실제 사회 상황에 대한 특정 정보를 수집하는 것을 방지한다. 따라서, 우리는 protoco를 선호난 (자유롭게 이동 발정 여성으로) 여기에 설명. 또한 변이주에서 쥐를 테스트 할 때 항상 동일한 균주로부터 도입 마우스를 사용하고, 음독 생쥐 한 쌍의 데이터를 분석하도록 추천한다. 최근의 연구는 이미 터 (31)를 지역화하는 삼각 측량의 사용을 촉진합니다. 이 연구에서, 여성은 남성과 만남 동안 초음파 발성을 방출하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 그들이 기록 세션 전에 적어도 2 주 동안 단리 하였다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 비디오 녹화가 적절히 동기화되는 경우 본 연구에서 제안하는 삼각 측량의 사용의 일반화 그럼에도 불구하고 대부분의 경우에 발성의 이미 터의 식별을 허용한다.
개발하는 동안 기록 된 새끼에서 분리 호출은 침대에서 배경 잡음에 의해 방해되지 않습니다. 일반적으로 자동 분석의 주요 변수를 추출하는 것은 매우 잘 작동합니다. 반면, 성인에서 기록 발성은 D이다침구으로 이동하는 동물 배경 잡음에 의해 isturbed. 자동 분석이 실패 할 수 있으며, 따라서 수동 분석을 사용한다. 그럼에도 불구하고, 테스트 케이지에서 침구를 추가하면 (마우스가 마음에 들지 않는 것이) 맨 손으로 흙보다 동물에 대한 스트레스를 덜 수 있습니다 조건을 제공해야한다. 지역 사회에서 또한 노력은 다양한 조건 하에서도 그 의미 배경 소음을 초음파 발성의 자동 검출 개선에 집중되어있다. 예를 들어, 음성 소프트웨어를 수동으로 배경 소음 (32)의 부재 선택했다 발성을 분석 할 수 있습니다. 이 소프트웨어에서 음향 변수의 추출은 자동이지만 초기 수동 선택이 필요합니다.
이 개체 간 변이 생쥐의 음성 동작에 매우 중요하다는 것을 주목해야한다. 예를 들어, 여성의 발정 존재 성인 남성의 전화 속도가 매우 (도 1)에 분포한다. 우리 스와실험 문맥과 관련된 변화를 제한하기 위해 이미 초음파 발성을 유도하기 위해 이러한 표준 프로토콜 ggest. 그럼에도 불구하고, 우리는 무엇보다도 작은 사이즈 (33)의 샘플의 개별 점 데이터의 평균값과 SEM뿐만 제시의 중요성을 지적하고 싶지만 것이다. 대표 데이터를 수집하기 위해 각 그룹 / 유전자형의 적어도 12 개인을 기록 – 그렇지 않으면 필요한 – 또한 아주 적합하다. 많은 경우, 개체 간 변이 (보통가 될 수 없음) 숨겨되지 않아야하고, 개인 연구 된 돌연변이 유전자를 운반하지만 어떤 비정형 표현형을 표시하지 식별 높은 중요 할 수도있다. 이러한 개인은 유전 질환의 치료를위한 새로운 경로를 열 수있는 보상에 대한 단서를 제공 할 수 있습니다.
신경 장애, 보컬 행동과 사회 연락처에 대한 마우스 모델의 대부분의 행동 특성 분석에서 고려하다에드 간격 (예를 들어, 19,27,34,35). 최근의 분석 방법은 이제 (예 MiceProfiler 사용) 상호 작용 (36)뿐만 아니라 오디오 레코딩의 데이터를이 분석을 결합하는 가능성 동안에 행사 및 이벤트 시퀀스 반자동 상세한 특성을 제공한다. 이 방법의 주요 이점은 더 정확하게 사회적 통신의 양태가 영향을 받는지를 식별하는 ASD의 마우스 모델에서 사회적 통신의 광범위한 관점을 제공하는 것이다. 본 프로토콜의 동기화가 여전히 수동이지만 이것은 음성 기록 소프트웨어를 통해 비디오 레코딩을 트리거링함으로써 개선 될 수있다. 분석이 종류의 신경 질환의 마우스 모델에서 사회적 통신 적자의보다 포괄적 인 뷰를 제공하는 표준이 될 것이다. 또한, 지금까지 대부분의 음성 신호는 이미 터 측으로부터 분석 (즉, 시험 VO의 방출을 선호 구축테스트 마우스에 의해 칼 신호, 본 프로토콜에서와 같이). 초점은 이제 더 이러한 음향 신호의 기능을 식별하기 위해,이 신호의 수신에 설정되어야한다. 이것은하거나 새로운 프로토콜을 설정하여 재생 실험을 이용하여 16도 (예 MiceProfiler 사용) 성인 본 프로토콜의 새로운 코너 마우스의 행동 (36)을 평가함으로써 수행한다. 실제로, 본 프로토콜은 마우스의 발성 방출의 정확한 ethological 조건을 반영하지 않을 수 있습니다 매우 제한된 상황을 제공한다. 초음파 발성의 자연 방출은 마우스의 자발적인 보컬 행동에 더 많은 빛을 흘렸다 지속적인 오디오 및 비디오 레코딩을 사용하여 더 나은 특성화해야합니다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Fondation de France; by the ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]; by the ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]; by Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM); by the Fondation Orange; by the Fondation FondaMentale; by the Fondation de France; by the Fondation Bettencourt-Schueller. The research leading to this article has also received support from the Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking under grant agreement no. 115300, resources of which are composed of financial contribution from the European Union’s Seventh Framework Program (FP7/2007-2013) and EFPIA companies’ in kind contribution. We thank Julie Lévi-Strauss for helpful comments on the manuscript and six anonymous reviewers whose comments noticeably improved the manuscript.
needles 0.3 x 13 mm [30G 1/2"] | BD Microlance | 304000 | – |
green tattoo paste | Ketchum Manufacturing Inc., Ottawa, Canada | 329AA | – |
thermometer | Fisherbrand, Waltham, USA | 4126 (W255NA) | – |
self-made soundproof chamber (pups) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + plexiglas; inside dimensions (W x H x D): 32 x 33 x 32 cm |
small surface thermister + single probe thermocouple | Harvard Apparatus | 599814 + 601956 | – |
smell-less pen | for instance: Giotto | – | ink made with water, washable: these pens are designed for babies |
Ethanol absolute (100%) | Sigma Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France | 24103 | diluted 1/10 |
Condenser ultrasound microphone Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | furnished with extension cables by the Avisoft company |
Ultrasound Gate 416H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34163 | sound card |
Avisoft Recorder USGH | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10301; #10302 | recording software for Windows Vista, 7 and 8 |
Avisoft SASLab Pro | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, 10111; #10102, 10112; | Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista including Intel-based Apple Macintosh running Boot Camp, Parallels or similar virtualization software. |
Laptop or Apple Macintosh running Boot Camp | – | – | running Windows 10, 8.1, 8, 7 or Vista; for the Apple Macintosh, Boot Camp is preferred to virtualizations softwares such as Parallels due to memory constraints |
plastic recipient (pup recordings) | Lock & Lock, Chatswood, USA | HPL932D | Lock & Lock Stackable Airtight Container Round 700ml; use without the cover; dimensions: 9 cm diameter, 10 cm height |
PBS 1X (pH=7.4) | Gibco (Life Technologies) | 10010-023 | – |
slides | Menzel-Gläser, Thermo Scientific | J1800AMNZ | Superfrost Plus |
May-Grünwald solution 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 320070-0500 | – |
Giemsa R 500 ml | RAL Réactifs, Martillac, France | 720-1107 | diluted 1/20 in phosphate buffer solution |
phosphate buffer solution (self-made) | – | – | pH=7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100 ml H2O (final volume: 200 ml) |
test cage | Institut Pasteur, Paris | – | 50 x 25 cm, 30 cm height; Plexiglas |
self-made soundproof chamber (adult recordings) | Institut Pasteur, Paris | – | acoustic foam + PVC; inside dimensions (W x H x D): 66 x 90 x 46 cm |
video camera | From Noldus Information Technologies, Wageningen, The Netherlands | – | high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps |
EthoVision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt | video acquisition software |
Mice Profiler Tracker plugin from the ICY platform | Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris | http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker | tracking software to analyse behavioral events during social interactions |