胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御
Summary
遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。
Abstract
特定の遺伝子の転写は、胚発生の間の細胞運命決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。生物学的プロセスは、心臓、構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノムの調節領域に結合する転写因子によって媒介されます。 DNAは、化学修飾に供されるヒストンの周りに巻かれています。ヒストンの修飾は、さらにこのように、遺伝子転写の微調整調節の別のレベルをもたらし、抑圧、アクティブまたは構え遺伝子転写につながります。胚性幹細胞（ES細胞）は、心臓発生の初期段階の胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養で再現します。それらは、クロマチン免疫沈降（チップ）のための原則に十分な材料、広く遺伝子調節領域を同定するために使用される技術の提供します。また、ヒトES細胞は、心臓のヒト細胞モデルを表します。開発の後期段階では、マウス胚組織はを可能にセルIDを決意するために必要な具体的なエピジェネティックな風景を調べます。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚性領域を用いたPCRまたはチップ・シーケンシングに続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。
Introduction
心臓は最初の器官が形成されると、胚における機能的になることです。心臓は、第1および第2の胚性心臓フィールド1から発生する多くの細胞系譜から構築されています。受精後の胚盤胞は、成形心まで段階から、胚細胞は、多くの細胞の運命決定を行うためにこのようにしてあります。遺伝子の転写は、時間と空間依存的に調節され、胚発生の間の細胞運命の決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。このような方法は、心臓構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノム内の調節領域に結合する特異的転写因子によって媒介されます。 DNAは、例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、および/またはリン酸化などの修飾に供されたヒストンの周りに巻かれています。ヒストン修飾は、ヒストンのリジン残基が2に変更されているに応じて活性化し、抑圧や構え遺伝子転写につながります。
jove_content ">クロマチン免疫沈降アッセイ（チップ）年前に3を設定し、4。ヒストンや転写因子の免疫沈降後に変更されたヒストンや転写因子のいずれかの標的を同定するために、現在最も広く使用されている技術であるされてきた、結合したDNAをすることができますいずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅または配列決定した。チップは、技術的挑戦ゲル遅延アッセイ5を克服している。しかし、チップはDNA、ゲル遅延アッセイの利点の転写因子の結合を直接意味するものではない。一方、チップ上DNAシークエンシングに合わせた遺伝子調節に関する新たなゲノムワイドな視点をオープンしました。ES細胞（ES細胞）を6胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養において心臓の開発の初期段階を再現し、チップのための原則に十分な材料に提供します。また、ヒトES細胞は、CAのヒト細胞モデルを表しますその心原性の潜在的なもののrdiogenesisはそのエピジェネティックな署名7に依存します。開発の後期段階では、マウス胚組織は、セル識別の決意に必要な特定のエピジェネティックな景観を調査することを可能にします。しかし、ゲノムは時間と細胞型に特異的な様式8に転写されます。遺伝子転写のエピジェネティック制御は、局所領域内で検討されなければなりません。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚領域を使用して、PCRまたは配列決定に続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
エピジェネティクスは、発生生物学の研究の重要な分野となっています。遺伝的プログラムは、胚系統内の特定のIDを取得するに細胞を可能にするために胚細胞で活性化されているどのくらいの時間のために、発生生物学者にとって重要な問題となっています。
チップは広く最後の年以内に使用し、シークエンシングの解像性の向上、次のDNA配列決定に組み合わされてい…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
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