İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
hücre ve moleküler biyoloji en güncel çalışmalar nüfus ortalamasına dayanmaktadır. küçük popülasyonlar biyolojik süreçlerin ve hastalık sonucu önemli roller oynayabilir Bununla birlikte, önemli biyolojik olaylar bu geleneksel toplum tabanlı analizler maskelenmiş olabilir. Tek hücre düzeyinde heterojen popülasyonlar gen ifadesini anlama (ve vardır) ilgili biyolojik ve klinik Insights 1,2 yol açabilir. Embriyonik gelişim çalışmalarına ilgilendiren, daha büyük bir hücre popülasyonunda, progenitör hücreler, çoğunlukla az temsil edilmektedir zorlu sonuçta hücre kaderinin kararları 3 başlatmak gen ifadesinde ince değişiklikleri tespit etmek için yapım. Benzer şekilde, tek bir hücre tipi mikro-4 tepki olarak farklı ekspresyon profillerine sahip olabilir. Örneğin, (örneğin., Aort veya böbrek) aynı organ veya farklı organlarda yerleşik endotel hücreleri ortak Morp paylaşımı rağmen önemli heterojeniteye sergilerlerlitolojik ve fonksiyonel özellikleri 5. Buna ek olarak, aynı tümör doldurma kanser hücreleri, aynı zamanda, tek hücre düzeyinde 6 moleküler profiller ya da mutasyonlar farklı olabilir.
Modeli sistemlerinde, tek hücre transkriptomik başarılı yeni hücre popülasyonu tespit hücre farklılaşması sırasında meydana gelen ara durumları, özelliği ve 7,8,9 uyaranlara diferansiyel hücresel tepkileri ortaya çıkarmıştır. Bu tür anlayışlar, geleneksel toplum tabanlı çalışmalarda maskeli olurdu. Zebra balığı embriyolar kök, dede bir derece altında kullanılan kaynağıdır ve geliştirme sırasında tek hücre heterojenite ve hücresel kimliklerin moleküler düzenleme soruları keşfetmek için hücrelerin ayırt. Onların son derece basmakalıp, ex vivo geliştirme ve genetik manipülasyon kolaylığı onlara bu yaklaşımın 10,11 için mükemmel bir model sistem olun. Özellikle, tek hücre gen yorumlanması önemli bir sınırlamae ifade veri gelişimi sırasında yeni ara hücre devletlerin güvenilir kimlik doku koleksiyonu 9 çok dikkatli zamanlama gerektirir. Bu tutulan hücre arasındaki farklılıklar, yaşa bağlı hücre farklılaşması tarafından sunulan gen ekspresyonu, tek bir zaman noktasında bir doku içinde heterojen yerine heterojen temsil sağlamak için gereklidir. Fareler ile karşılaştırıldığında, zebra balığı embriyo gelişimi tam olarak embriyoların 12 çok sayıda senkronize edilebilir. Buna ek olarak, geniş bir kavrama boyutları ile, zebra balığı embriyolar kök ve projenitör hücre bol kaynağı olarak kullanılabilir.
Bu protokol, zebra balığı embriyoların hücreleri izole etmek ve QRT-PCR ile gen ekspresyon analizi için ticari olarak temin edilebilir, entegre Mikroakiskan devresi (IFC) çipi ve otoprep sistemi kullanılarak tek hücre yakalamak için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu protokol, bütün dahil olmak üzere herhangi bir yüksek verimli çoğullama deneyleri hızla devredilecek olabilirHücresel heterojenite 13 daha kapsamlı analiz sağlar transcriptome sıralama. Ayrıca, geleneksel gen sentezleme tahlilleri için çeşitli avantajlar sağlar. Tek hücre izolasyon protokolü alt uygulamalar dahildir tehlikeye hücrelerinin oranını azaltır FACS sonrasında yüksek canlılığı, elde edilir. Bir IFC kullanarak, yakalanan hücreler doğrudan yakalama oranlarını değerlendirmek ve morfolojik hücre sağlığını değerlendirmek için görülebilir. Buna ek olarak, bu protokol mikroakışkan hücre yakalama teknolojileri sadece etiketli transgenik balık hattı ve erişimi gerektiren, Zebra balığı araştırma topluluğuna geniş çapta uygulanabilir.
Prensip kanıtı olarak, kalp progenitörlerinden edilen tek hücreler izole edilmiş ve bir IFC çip ele geçirilir ve daha sonra kalp farklılaşma markerlerinin nispi bolluk QRT-PCR ile ölçülmüştür. tek hücre düzeyinde gen ekspresyon analizi kalp atalarıdır kendi differe bir arada gösteriyorntiating soyu. Kalp atalarıdır tek hücreli profil elde edilen anlayış, geleneksel toplum tabanlı analizlerde maskelenmiş olabilir omurgalı gelişimi sırasında kalp progenitör hücreleri arasında gen ekspresyonu heterojenlikten, ışık tutabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada tarif edilen yöntem, bir kardiyak genlerin bir alt ekspresyonunu değerlendirmek için mikro-akışkan destekli tek hücre yakalama sisteminde kullanım için zebra balığı embriyolardan kalp progenitör hücrelerin bir popülasyonu ettirecek hücre tipi özel bir promoterin kontrolü altında bir floresan protein ifade kullanır hücreler. FACS lazer eksitasyon ve emisyon özellikleri tercih fluorofor (ler) ile uyumlu olduğu sürece, bu yöntem, herhangi bir flüoresan raportör hattı için kullanılabilir….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
