여기에서는 성인 피부 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 변환할 수 있는 새로운 방법을 제시합니다. 이 기술은 후성유전학적 변환을 기반으로 하며, 레트로바이러스 벡터의 사용이나 안정적인 만능 상태의 획득을 포함하지 않습니다. 따라서 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.
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이 논문에서
요약
초록
재생 의학은 퇴화되거나 손상된 조직을 복구하기 위해 환자에게 전달되는 완전히 기능하는 새로운 세포를 필요로 합니다. 이러한 세포를 쉽게 사용할 수 없는 경우, 많은 것 중에서 재프로그래밍(reprogramming) 및 트랜스-분화(trans-differentiation)를 포함하는 다양한 접근법을 사용하여 얻을 수 있으며, 이는 서로 다른 기술에 특이적인 장점과 한계를 가지고 있습니다. 여기에서는 성숙한 성숙한 섬유아세포를 인슐린 분비 세포로 전환하기 위한 새로운 전략이 설명되며, 이는 임의로 후성유전학적 전환세포(EpiCC)로 지정됩니다. 이 방법은 세포 운명의 후성유전학적 조절과 분화를 제어하는 메커니즘에 대한 이해가 높아짐에 따라 개발되었습니다. 특히, 첫 번째 단계는 후성유전학적 변형자, 즉 5-아자-시티딘을 사용하여 성체 세포를 "매우 허용적인" 상태로 만듭니다. 그런 다음 이 짧고 되돌릴 수 있는 후성유전학적 가소성의 창을 활용하여 세포를 다른 계통으로 다시 처리합니다. 이 접근법은 "후성유전학적 세포 전환"이라고 명명됩니다. 이는 효율적이고 제어되며 안정적인 세포 계간 스위치를 얻을 수 있는 간단하고 강력한 방법입니다. 이 프로토콜은 유전자 transfection의 사용을 포함하지 않기 때문에 바이러스 벡터가 없고 안정적인 만능 상태를 포함하지 않기 때문에 중개 의학 응용 분야에 매우 유망합니다.
서론
재생 의료의 기본적인 목적은 수리되거나 손상된 대체 할 수있는 새로운 기능성 세포의 세대, 조직 변성. 다른 하나의 세포 유형에서 그들을 변환하여, 새로운에 쉽게 사용할 성인 세포 개조하기 필요한 세포 집단 액세스가 풍부하거나 어렵지 않다 특히, 특히 매력적인 방법이다. 그러나, 성인 세포는 매우 안정하다. 그들은 성숙한 터미널 전문화에 도달하면, 그들은 안정적는 1을 유지, 자신의 선택에 점진적으로 제한을 통해 차별화 된 상태를 취득합니다.
체세포 (IPS)의 다 능성을 재 프로그래밍을 가능하게하는 프로토콜 번호가 개발되었으며 최근 년에 전사 세트 2,3- 요인의 강제 발현을 통해 달성. 또한, 셀 변환 (4) 하나를 소개, 직접 혈통의 분화에 의해 얻을 수있다 또는 전사의 조합은 5-7 요인. 이 전략은 역 분화 상태를 통해 전환을 포함하지만, 특정 전사가 8 요인의 고 발현을 필요로하지 않습니다.
우리는 최근 시티 딘 유사체 5- 아자 시티 딘 (5 아자 - CR), 잘 특징 DNA의 메틸화 억제제의 탈 메틸화 특성 성체 세포의 짧은 노출에 기초하여 변환 프로토콜을 개발했....
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프로토콜
주의 : 아래에 기재된 모든 절차를 무균 상태에서 층류 후드에서 수행되어야한다. 그들의 처리에 걸쳐 37 ° C에서 모든 문화 절차가 온도 조절 단계에서 수행하는 세포가 유지되어 있는지 확인합니다.
1. 피부 섬유 아세포의 분리
- 문화 접시 코팅액을 제조
- 물 (최종 농도 0.1 %) 100 ㎖에 돼지 젤라틴 0.1 g을 녹인다. 오토 클레이브와 솔루션을 소독.
- 35mm 배양 접시에 무균 0.1 % 돼지 젤라틴의 1.5 ML을 추가합니다. 실온에서 그들을 유지, 코트에 2 시간을 기다립니다.
주 : 인간의 피부 생검 전완의 앞쪽 양태의 무 혈관 영역에서 국소 마취 절제하여 수거하고, 사용하기 전에 4 ℃에서 2 % 항생제 항진균제 용액이 보충 된 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS)에 저장된다.
- 새로운 PBS로 세척 생검은 2 % antibi 보충귀 안티 곰팡이 솔루션입니다.
- 장소 a를 100mm 페트리 접시에 조직 검사와 멸균 메스와 약 2mm 3 조각으로 잘라.
- 단편 도금 직전에 도포 액의 과도한 제거.
- 사전 코팅 35mm 페트리 접시에 5-6 피부 조각을 놓습니다.
- 섬유 아세포 배양....
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결과
피부 생검에서 차 문화의 설립
피부 생검은 작은 조각으로 잘라 젤라틴 미리 코팅 요리에 넣었다. 육일 후, 섬유 아세포는 조직 조각에서 성장하기 시작하고 세포 단층 (그림 1A)을 형성했다. 세포는 전형적인 긴 형태를 보여, 예상대로 섬유 아세포 특정 마커 멘틴 (빔, 그림 1B)의 균일 한 면역 양성을 표시.
5 아자 - CR에 18 시간 노출 후 피부 섬유 아 세포의 형태 학적 변화와 메틸화 패턴
인슐린 분비 세포로 섬유 아세포의 성공적인 후생 유전 학적 변환을 얻으려면, 우리는 탈 메틸 화제, 5 아자 - CR을 사용하여 가소성을 증가했다. 인간 섬유 아세포를 7.8 × 104 아세포 / ㎠의 농도로 0.1 % 젤라틴 프레 코트 접.......
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토론
본 논문은 조직 특이 적, 유도 프로토콜이어서 5- 아자 CR에 과도 짧은 노광, 인슐린 생산 세포에 인간의 피부 섬유 아세포의 변환을 허용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 전사 인자 또는 마이크로 RNA의 강제 표현이나 세포가 더 불안정하고 실수 (14)하는 경향이 있습니다 안정적인 만능 상태의 취득없이, 중배엽에서 내배엽과 관련된 세포로 전환 할 수 있습니다.
첫 번째 단계에서, 세포 가소성 말단 분화 세포에 일시적, 가역적 허용 상태를 유도하는 합성 후생 유전 학적 개질제로 확실히 증가한다. 특히, 5- 아자 - CR은 피부 섬유 아세포의 전체 메틸화의 감소를 야기하기 위해 사용되었다. 5- 아자 CR 직접 메틸 전이 효소의 활성을 억제하고, 새로 합성 된 DNA 메틸화에 새로이를 방지하는 것으로 알려져있다. 때문에 그 효과,이 분자이전 자동 유전자를 활성화 할뿐만 아니라 15,16 진핵 세포의 분화 상태를 변경하는.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 Carraresi 재단과 당뇨병 연구를위한 유럽 재단 (EFSD)에 의해 투자되었다. GP는 밀라노 대학의 후 문서의 교제에 의해 지원됩니다. 후성 유전학과 Periconception 환경과 BM1308 공유 큰 동물 모델에서 진행 비용 조치 (살람) : 저자는 비용 작업 FA1201 Epiconcept의 구성원입니다. TALB은 비용 조치 CM1406 성적인 화학 생물학 (EPICHEM)의 회원입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco의 인산염 완충 식염수 | Sigma | D5652 | PBS; 세포 세척 및 용액 준비용 |
| 항생제 항진균 용액 | Sigma | A5955 | 섬유아세포, HP 및 췌장 매체의 구성 요소 |
| 100 mm 페트리 접시 | Sarstedt | 83.3902 | 섬유아세포 분리용 |
| 돼지 젤라틴 | 시그마 | G1890 | 접시 코팅용 |
| 물 | : 시그마 | W3500 | 용액 준비 |
| 용 35mm 페트리 접시 | Sarstedt | 83.39 | 섬유 아세포 분리 |
| DMEM, 고 포도당, 피루브 산 | 생명 기술 | 41966052 | 섬유 아세포 배양 매체 |
| 태아 소 혈청 | 생명 기술 | 10500064 | FBS; 섬유 아세포 및 HP 매체 |
| L-글루타민 용액 | 요소 Sigma | G7513 | 섬유 아세포, HP 및 췌장 매체 |
| 트립신-EDTA 용액 | 아세포 해리용 | ||
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 | 포함 Hycor Biomedical | 87144 | 세포 계수 |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, increrase 세포용 섬유아세포의 가소성 |
| Ham's F-10 영양 혼합물 | Life Technologies | 31550031 | HP 매체 |
| DMEM, 저포도당, 피루브산 | Life Technologies | 31885023 | HP 매체 |
| 녹아웃 혈청 교체 | Life Technologies | 10828028 | HP 매체 |
| MEM 비필수 아미노산 솔루션의 | Life Technologies | 11140035 | HP 및 췌장 기저 매체의 구성 |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 | M7522 | HP 및 췌장 기초 매체의 구성 |
| 구아노신 | 시그마 | G6264 | 뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의 성분 |
| 아데노신 | 시그마 | A4036 | 뉴클레오시드 믹스 원료 HP 매체의 |
| 티딘 | 시그마 | C4654 | 뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체 |
| Uridine | Sigma | U3003 | HP 매체 |
| Thymidine | Sigma | T1895 | 뉴클레오시드 믹스 원료 성분 HP 매체 |
| Millex-GS 0,22 µ의 뉴클레오시드 혼합 원료 성분; m | Millipore | SLGS033SB | 용액 |
| FGF-Basic (AA 1-155) 재조합 인간 단백질 | 생명 기술 | PHG0261 | bFGF의 살균을 위해; HP 및 췌장 기저 매체 |
| 소 혈청 알부민 | 시그마 | A3311 | ; 췌장 기저 매체의 구성 |
| DMEM / F-12 | Life Technologies | 11320074 | 췌장 기초 매체 |
| B-27 보충제 마이너스 비타민 A | 라이프 테크놀로지 | 12587010 | 췌장 매체 |
| N-2 보충제 | 라이프 테크놀로지 | 17502048 | 췌장 기초 매체 |
| 액티빈 A 재조합 인간 단백질 | 라이프 테크 | PHG9014 | 췌장 매체 |
| 레티노산 | 시그마 | R2625 | 췌장 매체 |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마 | D2650 | DMSO; 레티노산 재고 준비 |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄 | 생명 기술 | 41400045 | ITS; 췌장 최종 매체 |
| 항-바이멘틴 항체 | Abcam | ab8069 | 면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | 시그마 | 32670 | DAPI. 면역세포화학 분석용. 작업 희석 1 &마이크로; g/ml |
| 5-메틸시티딘 | Eurogentec | MMS-900P-B | 면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:500 |
| Anti-C 펩타이드 항체 | Abcam | ab14181 | 면역세포화학 분석용. 작동 희석 1:100 |
| Anti-PDX1 항체 | Abcam | ab47267 | 면역세포화학 분석기용. 작동 희석 1:500 |
| Mercodia 인슐린 ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | 인슐린 방출 감지용 |
참고문헌
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic ....
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재인쇄 및 허가
