완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소
Summary
A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.
Abstract
완두콩 진딧물 Acyrthosiphon의 pisum는 시퀀스 된 게놈과 풍부한 표현형 소성으로, 게놈 및 개발 연구를위한 새로운 모델이되고있다. 다른 진딧물, 등을들 수있다. pisum은 배아가 ovariole의 조립 라인 방식으로 계란 챔버 내에서 개발 처녀 생식 태생 재생을 통해 빠르게 전파. 이전에 우리는 진딧물의 배아에서 mRNA 발현의 검출을 허용 현장 하이브리드의 전체 마운트의 강력한 플랫폼을 설립했다. 단백질의 발현을 분석하지만, 만족스러운 결과를 생성하지 않았다 무성 태생 진딧물의 ovarioles를 면역 염색을위한 프로토콜을 설립했다. 여기에서 우리는 조직 투과성을 증가 설립 방식을 적용 할 때 문제가 있었다 둘 배경 염색을 감소시키는 최적의 조건을보고합니다. 최적화는 다음과 같습니다 필수 F 발견 된 단백질 분해 효소 K (1 μg의 / ㎖, 10 분),의 (1) 배양중간 및 말기 진딧물 배아 또는 항체 침투; 디곡시 제닌 (DIG)에 의해 공급 차단 시약 정상 염소 혈청 / 소 혈청 알부민 (2) 여분 세트 버퍼와 내인성 퍼 옥시다아제 표백 메탄올 오히려 과산화수소 (H 2 O 2), (3)베이스 어플리케이션; 이는 크게 진딧물 조직에서 배경 염색을 감소시켰다. 면역 염색에 최적화 된이 중요한 조건은. pisum과 다른 진딧물의 배아에서 유전자 산물의 효율적인 검색을하실 수 있습니다.
Introduction
진딧물은 작은 (1-10mm) 소프트 기관과 hemipteran 곤충이다. 그들은 피어싱 구기와 체관부 수액을 빨아 식물을 먹고. 또한, 그들은 체관부 수액 다이어트 결핍 필수 아미노산을 합성, 의무적 endosymbiotic 세균 Buchnera의 aphidicola에 의존한다. 진딧물은 봄과 여름 긴 일 photoperiods 그들이 월동 계란 1, 2의 제한된 수의 누워있는 동안 짧은 일 photoperiods에 의해 트리거 성적 난생 재생시 처녀 생식 태생 재생을 포함하는 복잡한 삶의 역사를 가지고 있습니다. 봄이 계란 가을까지 처녀 생식 재생의 많은 라운드를 다음, 모든 여성 진딧물 (fundatrices)의 첫 번째 세대를 생산하기 위해 부화. 연간 라이프 사이클에 무성 성적 단계의 대체가 진화 참신 1,2로 간주 된 진딧물에 순환 처녀 생식. 처녀 생식 태생 진딧물에서, 배아는 난소 세관 (ovarioles)의 달걀 챔버 내에서 발생한다. 반면, 성적 난생 배아는 수정란에서 개발. 외에도 생식 소성에서, 진딧물은 transgenerational 날개 polyphenism를 표시 할 수 있습니다 과밀 신호와 포식자의 위협에 대한 응답으로, unwinged 성별이 여성은 viviparously 장거리 이동을위한 날개 자손을 생성 할 수 있습니다. 완두콩 진딧물의 게놈 시퀀스의 출판 Acyrthosiphon pisum 년 -에 대한 최초의 게놈 서열을 기초 hemimetabolous 곤충 – 수 생식 소성, 날개 polyphenism 및 분자에 진딧물 곤충 – 식물의 상호 작용, 바이러스 벡터링과 공생을 포함한 다른 기능의 추가 탐사 기준 3.
시퀀스 된 게놈 외에, 유전자 발현과 기능을 특성화 툴 성숙한 모델 생물로서 4 완두 진딧물을 촉진해야한다. 우리는 전체 마운트의 강력한 프로토콜을 설명했다 <em> 진딧물 배아 5-7에서의 mRNA의 발현을 검출하기위한 현장 하이브리드에. 이중 가닥 RNA 주입 및 이송을 통해 RNA 간섭 (RNAi) 진딧물 약충 및 성인에서 유전자 침묵에 사용되었지만, 배아 유전자 녹다운을위한 조건은 아직 안정 8-10보고되지 않았다. 면역 염색 및 RNAi의 최저 후, 완두콩 진딧물 배아 11-13에서 수행되기 전에 샘플에서 단백질 발현을 검출 할 수있는 항체 기반의 접근 방식. 그러나, 조직 투과성 및 배경 얼룩 제거의 증가는 완두콩 진딧물의 무성 태생 배아에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜을 사용하여 아직 만족스럽지 못하다. 예를 들어, 우리는 조직에 대한 항체의 침투 gastrulating 배아 감소 발견 (8-10 스테이지)과 형태 학적으로 식별 사지 싹 (단계 13 ~ 14)와 배아 항체에 거의 투과 있다고. 또한, 배경 염색은 무성 viviparo에 가시화생식 세포 마커 바사뿐만 아니라 그에 대한 배아 세그먼트 (12, 13)로 표현 Engrailed / Invected 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색 우리 완두콩 진딧물의 배아. 사실 배경 염색은 여전히 혼자 차 항체로 염색 배아에서 분명히 볼 수 있었다.
진딧물 조직의 완전성을 손상시키지 않고 투과성을 증가시키기 위해, 우리는 신중 테 K의 농도를 적정하고 진딧물 배아 조직 분해를위한 최적의 조건을 결정 하였다. 완두 진딧물에 비특이적 염색을 방지하기 위해, 우리는 배아를 효과적으로 차단하고 내인성 퍼 옥시다아제 (POD)의 활성, 면역 동안 신호를 증폭하기 위해 사용되는 효소를 억제 할 수있는 화합물을 검색. 전통적으로 사용되는 표준 오히려 염소 혈청 (NGS), 디곡시 제닌 (DIG) 기반 버퍼 세트에 의해 제공되는 차단 시약 / 소 혈청 알부민 (BSA)을 크게 백그라운드 염색을 감소시켰다. 또한, 메탄올 INHI였다과산화수소보다 효과적으로 POD 내인성 활성 비트 (H 2 O 2). 배아에 대한 면역 염색에 대한 이러한 진딧물 특정 조건에 관한 세부 사항은 다음 절에서 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 완두콩 진딧물에 성공 면역에 중요한 최적의 조건을 확인했다. pisum, 게놈과 발달 연구 3,15에 대한 새로운 모델 생물. 조직 투과성을 증가시키고, 배경 얼룩을 감소시키기위한 최적 조건은 신호 강도 및 특이성을 향상. 이들은 세포막에 구멍을 만들고 결합 비 – 특이 적 항체를 차단하는 단계에서 다른 동물 모델에서 면역 염색을위한 표준 프로토콜이 다르다.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Chau-Ti Ting (Fly Core in Taiwan) for providing the monoclonal 4D9 antibody, Technology Commons (TechComm) of the College of Life Science NTU for confocal microscopy, Hsiao-Ling Lu for proofreading the manuscript, and Chen-yo Chung for helping filming. CC particularly thanks Charles E. Cook for providing strategic suggestions and for critical editing of the manuscript. This work was supported by the Ministry of Science and Technology (101-2313-B-002-059-MY3 and 104-2313-B-002-022-MY3 for GWL and CC), and the National Taiwan University (NTU-CESRP 101R4602D3 for CC; 103R4000 for GWL).
Materials
| 30% hydrogen perxidase (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 18304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | For labeling the double-strand DNA. TOXIC. Wear gloves, dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| 4D9 anti-engrailed/invected mouse monoclonal antibody | Developmental studies hybridoma bank | AB_528224 | For labeling the developing segments of embryo. |
| ApVas1 rabbit polyclonal antibody | Our laboratory | N/A | For labeling the aphid germline specific Vas1 protein in embryos. This antibody was made by our laboratory. |
| Austerlitz Insect pins | ENTOMORAVIA | N/A | For seperating each egg chambers from an ovariole. Size 000, BLACK ENAMELLED. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Camera connted to compound microscope | Canon | EOS 5D | For photographing of aphid embryos. |
| Colorimetric 8 cell tray | Kartell Labware | 357 | For developing the staining signal of aphid embryos. Diameter 95 x 57 mm, cell depth 2 mm. |
| Compound microscope with DIC optics | Leica Microsystems | DMR | For photographing of aphid embryo mounted on the slides. |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Sigma-Aldrich (Roche) | 1.1586E+10 | For blocking the non-specific binding of antibodies. We diluted the 10X Blocking solution into 1X as blocking reagent. |
| Forceps | Ideal-tek | N/A | For dissection of ovaries from aphids. Manufacturer part No 5: 5 SA. |
| Glass dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from the splot plate to tubes. 150 mm of total length and 5 3/4" of tip length. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
| Glycine | Bioshop | N/A | For blocking the enzyme activity of proteinase K (PK). |
| Goat anti-mouse IgG conjugated Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11017 | For detection of primary antibody from mouse. |
| Goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 633 | Invitrogen | A21072 | For detection of primary antibody from rabbit. |
| Intelli mixer | ELMI laboratory equipment | RM-2M | For improving the thorughly reaction of reagents with ovaries. |
| Laser-scanning confocal microscopy | Leica Microsystems | SP5 | For photographing of aphid embryo mounted on the slides with florecent tag. |
| methanol | Burdick and Jackson | AH2304 | For bleaching endogenous peroxidase of embryos. |
| Microscope slides | Thermo scientific | 10143560 | For mounting of embryos. SUPERFROST ground edges, ca./env. 76 x 26 mm. |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101030 | For mounting embryos on the slides. Size 18 x 18 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| Microscope Cover glasses | Marienfeld | 0101050 | For mounting embryos on the slides. Size 22 x 22 mm. Thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| mouse monoclonal anti-alphaTubulin antibody (DM1A) | Santa Cruz Biotechnology | sc-32293 | For labeling the distrbution of alpha-tubulin of cells. |
| Nail polish | N/A | N/A | For sealing the coverslips on the slides. |
| Normal goat serum (NGS) | Sigma-Aldrich | G9023 | For blocking the non-specific binding of antibodies. |
| Paraformaldehyde (PFA) | VWR | MK262159 | For fixation of aphid ovaries. |
| Phalloidin-TRITC | Sigma-Aldrich | P1951 | For labeling the distrbution of F-actin on embryos. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | As isotonic solution for aphid ovaries. |
| Plastic dropper | N/A | N/A | For transfering ovaries of aphids from tube to cell tray. Size 3 ml. |
| Proteinase K | Merck | 124678 | For creating pores (punching) on the cell membrane and facilitating the access of antibodies. |
| Pyrex spot plate | N/A | N/A | For dissection and color reactions of aphid ovaries under microscopy. Each cavity with diameter 22 mm and depth 7 mm. |
| SIGMAFAST 3,3’-diaminobenzidine (DAB) tablets | Sigma-Aldrich | D4168 | For developing of substrated signals. Also called DAB peroxidase substrate tablet set. |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | EZ4 | For dissection and observation of aphid ovaries. |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | For creating pores (punching) on the cell membrane. |
| VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector laboratories | PK-6101 | For enhancement of the signal. Including of biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody, A and B reagents. |
| VECTASHIELD mounting medium | Vector laboratories | H1000 | For clearing of aphid embryos and mounting. |
References
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