Närvaron av cancerstamceller (CSCs) i bensarkom har nyligen satts i samband med deras patogenes. I den här artikeln presenterar vi isoleringen av CSCs från primära cellkulturer som erhållits från mänskliga biopsier av konventionell osteosarkom (OS) med hjälp av förmågan hos CSCs att växa under ickeadherenta förhållanden.
De nuvarande förbättringar i terapi mot osteosarkom (OS) har förlängt livet för cancerpatienter, men överlevnaden av fem år fortfarande dålig när metastaser har inträffat. Cancer Stem Cell (CSC) teori menar att det är en delmängd av tumörceller inom tumören som har stamceller liknande egenskaper, inklusive förmågan att upprätthålla tumören och att motstå multi kemoterapi. Därför behövs för att främja utvecklingen av riktade terapier för att utrota denna undergrupp och att minska sjukligheten och dödligheten bland patienter en bättre förståelse för OS biologi och patogenes. Isolera CSCs, upprättande av cellkulturer av CSCs, och studera deras biologi är viktiga steg för att förbättra vår förståelse av OS biologi och patogenes. Inrättandet av humanhärrörande OS-CSCs från biopsier av OS har möjliggjorts med hjälp av flera metoder, bland annat förmågan att skapa 3-dimensionella stamcellskulturer enligt nonadherent villkor. Under dessa betingelser, CSCs kan skapa sfäriska flytande kolonier bildade av dotterstamceller; dessa kolonier benämns "cellulära sfärer". Här beskriver vi en metod för att etablera CSC kulturer från primära cellkulturer av konventionell OS erhållen från OS-biopsier. Vi beskriver tydligt flera passager krävs för att isolera och karakterisera CSCs.
Sarkom är en heterogen grupp av sällsynta maligna bindvävnadstumörer härrör främst från den embryonala mesoderm en. De olika typerna inkluderar ben sarkom och mjukdelssarkom. Bensarkom, en grupp av förhållandevis ovanliga primära tumörer, bestå av flera undertyper, inklusive osteosarkom (OS). OS en av de vanligaste primära tumörer i ben, är en mesenkymala malignitet som uppvisar omfattande klinisk, histologiska och molekylära heterogeniteter 2, 3. Tyvärr inträffar OS främst barn och unga vuxna 4, 5 och står för 60% av gemensamma histologiska subtyper av ben sarkom i barndomen 6, 7. OS drabbar oftast de skelettområden, som kännetecknas av snabb tillväxt ben (t.ex. metafysen långa ben). Bland de histologiskt olika subtyper av OS, konventionell OS, även kallad medullär eller central OS har en hög grad av malignitet och en sha kvotre av 80% 8. Denna 80% består av 60% konventionell osteoblastisk OS, 10% chondroblastic OS och 10% fibroblastisk OS 6, 8-10. Andra OS subtyper inkluderar anaplastisk, telangiectatic, jätte cell rika och småcellig OS. Trots framsteg inom kombinerad kirurgi och kemoterapi i OS management, förblir resultatet dålig, med en långsiktig överlevnad på 65-70% hos patienter utan metastaser 11, 12. Distant återfall inträffar ofta som lungmetastaser eller mindre ofta, eftersom metastaser till avlägsna ben och lokala återfall 13. Metastaser är ofta resistenta mot konventionella behandlingar. Detta motstånd är anledningen till den 10-åriga sjukdomsfri överlevnad är ungefär 30% hos patienter med metastaserande sjukdom vid diagnos 14, 15.
Som med normal vävnad, är cancervävnad sammansatt av en heterogen samling av celltyper. Celler inom tumören verkar motsvara olika utvecklingsstadier. Inom varje normal vävnad befinner sig en subpopulation av celler med förmågan att selfrenew, vilket ger progenitorer och mogna celler för vävnads homeostas. På samma sätt är cancer består av en liknande heterogen population av celler i olika stadier av utveckling, med olika grader av proliferation och tumörframkallande potential. En undergrupp av dessa cancerceller, benämnda cancerstamceller (CSCS), utgör en reservoar av selfsustaining celler med den exklusiva förmåga att selfrenew och upprätthålla malign potential av tumörer, vilket genererar de olika cellinjer som utgör tumören bulk 16. Under 1990-talet, studier av akut myeloisk leukemi, förutsatt att första övertygande bevis för att det finns CSC subpopulationer 17, 18. CSCs har sedan isolerats från ett stort antal solida tumörer 19 och blir därmed en av de mest utforskade ämnen i cancerforskning. CSCs kan faktiskt uppstå från normala stamceller av mutationer i gener som gör den normalastamceller cancer 20-23. Flera transformerande mutationer och interaktion med mikro skulle också kunna bidra till friska stamceller och mogna celler förvärvar selfrenewal kapacitet och odödlighet som är typiska CSCs. Det finns flera hypoteser om denna omvandling. Friska stamceller, friska mogna celler och cancerceller, kan dedifferentiate till stamceller, få en stam-liknande fenotyp genom att aktivera selfrenewal associerade gener 24-28. Trots flera nya studier, ursprunget till CSCs har ännu inte upptäckt.
En särskild egenskap hos CSCs är att deras förmåga att motstå multiterapi tillvägagångssätt, som består av kombinerade kirurgi och kemoterapi med olika läkemedel. Nyligen genomförda studier har visat att CSCs också kan förvärva resistens mot cytotoxisk kemoterapi agenter. Möjliga förklaringar till detta motstånd inkluderar överuttryck av ATP-bindande kassett (ABC) multi transportör (dvs.MDR1 och BCRP1), överuttryck av kemoterapi enzymer såsom aldehyddehydrogenas en (ALDH1), och / eller förändringar i cellcykelkinetiken 30-33. Den direkta följden av alla dessa koncept som har beskrivits så här långt är att en cancerterapi skulle vara effektiv endast om den CSC subpopulation var helt elimineras, medan lokalt återfall eller avlägsen metastas kan inträffa om ens en enda CSC levde.
Upptäckten av CSCs i mänsklig sarkom 34, i synnerhet OS 35, eller i något annat ben och mjukdelscancer, har stor klinisk betydelse eftersom det ger en möjlig förklaring till varför många behandlingar verkar vara effektiva i början, men patienterna senare återfall. Därför är det hopp för framtiden kampen mot konventionell OS för att hitta nya och särskilda riktade terapier baserade på utvecklingen av innovativa läkemedel riktade mot OS-CSCS tack vare den molekylära karakteriseringen av denna underbefolkningen och att studiet av CSC biologi.
1992, Reynolds och kollegor, som var att undersöka huruvida en undergrupp av stamceller var närvarande i den vuxna däggdjurshjärnan, utvecklat en metod för att isolera celler som misstänks vara stam-liknande celler 36, 37. Denna metod är baserad på den speciella förmågan hos dessa celler för att bilda sfäriska kolonier när odlas under icke-vidhäftande förhållanden. Liknande tekniker användes av Gibbs och kollegor i 2005 för att studera en subpopulation av stamceller-liknande celler i ben sarkom 38. Att isolera och karakterisera OS-CSCs från primära cellkulturer av olika typer av konventionell OS, bestämde vi oss för att anpassa denna teknik för OS-cellinjer.
Här beskriver vi här anpassad metod av sfären bildningsanalysen, benämnd "sarcosphere analys", som kan användas för att isolera OS-CSCs från ändliga primära cellinjer härledda från humana biopsier av konventionell OS. Vi beskriver också alla tekniker used att validera stammen liknande CSC fenotyp av linjerna cell isolerad genom denna analys: 1) utvärdering av uttrycket av gener som kännetecknar pluripotenta embryonala stamceller (ESCS) och CD133-genen, som är en markör för CSCs; 2) kolonibildande enhet (CFU) -analys; 3) utvärdering av förmågan hos dessa celler att differentiera till osteoblaster och adipocyter under lämpliga differentieringsförhållanden; 4) undersökning av ytmarkörer av mesenkymala stamceller (MSC) (dvs, CD44, CD105 och Stro-1) genom immunofluorescens färgning och genom flödescytometrisk analys; 5) Utvärdering av ALDH-aktivitet hos dessa celler.
CSCs har flera egenskaper som gör det möjligt att identifiera denna särskilda cellulära underuppsättning i tumören bulk. På grundval av dessa egenskaper, såsom förvärvad resistens mot cytostatika medel för överuttryck av ATP-bindande kassett multi uttransportörer 28, 32, 33, eller för uppreglering av uttrycket av avgiftning enzymer såsom ALDH 32, för uttrycket av en speciell ytmarkör, såsom CD133, CD44, CD34, CD90, och andra 30, 34, 35, 41, ett flertal olika metoder för att isolera CSCs har utvecklats 42-44. En av dessa tekniker är den sfär-bildningsanalysen, som är baserad på förmågan hos CSCs att växa under icke-vidhäftande tillstånd.
Förmågan av vävnad stamceller och CSCs att bilda sfärer beskrevs första gången i studier på identifieringen av neurala stamceller av Reynolds et al. 37. Därefter, Gibbs et al. 38 ossed dessa studier att börja isolera CSCs från solida tumörer, i synnerhet från ben sarkom. Vi har beslutat att använda området bildandet analysmetoden illustreras av Gibbs et al. Att isolera CSCs från OSA cellinjer som erhållits från konventionella OS biopsier. Vi anpassat den ursprungliga metoden för att förbättra resultaten av denna analys och underlätta dess reproducerbarhet för andra cancercellinjer. Med hänvisning till upprättandet av sfären bildningsanalys verifierade vi att plätering 40.000 celler / brunn är en god praxis för att upprätthålla celler i isolering i början av analysen. Detta trick är mycket viktigt att undvika risken att de sfäriska kolonier kommer från cellulär aggregering och inte från den speciella och exklusiva kapaciteten hos en enda CSC att växa under icke-vidhäftande betingelser och bildar en sfärisk koloni. Denna förmåga är en särskilt kritisk punkt i denna analys.
Vi certifierade också att för att erhålla en bra hastighet av sfär bildningÄr det tillräckligt att uppdatera alikvoter av tillväxtfaktorer varje 3 d och inte varje dag, såsom beskrivs i den ursprungliga metoden. I denna studie har vi också etablerat och beskrivits utförligt en bra metod för att isolera de sfäriska kolonier som bildas när odlas under icke vidhäftande betingelser. Detta steg är kritiskt i denna analys eftersom det är mycket viktigt att försöka isolera så många av de sfärer som möjligt som bildas i varje brunn utan att skada dem. Det är också viktigt att isolera enbart de sfärer och inte de enskilda celler, vilket skulle kunna förbli i suspension under hela analysen. För att övervinna dessa kritiska punkter, har vi utvecklat en särskild isoleringsmetoden, vilket, såsom visas ovan, gav goda resultat för CSC isolering. Uppenbarligen finns det en möjlighet att inte alla de sfärer som bildas kan återvinnas, men förlusten i procent är mycket låg. I själva verket har vi också möjlighet att använda ett filter med 40 um porer för att isolera områden när de blir stora (blanketted cirka 100-200 celler).
Denna isolering stannar sfär formation men medger att enskilda celler, en del av metylcellulosa återstoden och minsta sfärer filtreras. Denna eliminering utförs genom noggrann filtrering som beskrivs i protokollet.
Dessutom valet av de största sfäriska kolonier genom 40 um mesh med åtföljande förlust av de minsta sfäriska kolonier gör att man kan välja CSCs med den högsta kapaciteten att bilda sfäriska kolonier och med större stemness. Alla dessa ändringar genomfördes för att förbättra analysen och att hjälpa forskare som studerar CSCs att förstå och återge det mest kritiska steget i den ursprungliga metoden av sfären bildningsanalys.
Bland de studier om in vitro-metoder för att isolera CSCs denna studie syftar till att visa hur detta anpassade sfär bildningsanalys kan vara en bra metod för att isolera CSCs frånOSA-cellinjer. De anpassningar till den ursprungliga metoden och den detaljerade isoleringsteknik beskrivs förbättra dess effektivitet. På kort tid kan god antal CSCs erhållas och användas för flera experiment. Därför är det möjligt att snabbt bekräfta stammen liknande fenotyper och i synnerhet, för att studera den dubbla stammen-liknande fenotyp som kännetecknar OS-CSCs. Således kan denna modifierade analys vara en bra teknik för att isolera CSCs och studera deras biologi. I framtiden, denna metod, med ytterligare anpassningar, kan också användas för att isolera CSCs från andra finita cancercellinjer som erhållits genom biopsier av sällsynta fasta tumörer.
Möjligheten att isolera CSCs från sällsynta solida tumörer, såsom OS, tillåter inte bara en förbättring av studier om detta särskilt cancer utan även omfattar studier av olika typer av cancer för att utveckla bättre metoder för deras isolering och framtida studier av biologi denna viktiga cellulära delmängden. Därför, som vihar gjort i denna studie, är det viktigt att förbättra metoderna för CSC isolering genom studier av CSC biologi, med det slutliga målet att hitta molekylära mål och utveckla en mycket specifik cancerbehandling riktad mot denna cellulära delmängd, som är troligen ansvarig för upprätthållandet av den primära tumören, utvecklingen av dess återkommande, och uppkomsten av metastaser i flera organ. Studiet av CSC biologi är också viktigt för att hitta behandlingar som kan vara skarp i bota cancer, såsom OS, där överlevnaden efter neoadjuvant behandling är fortfarande mycket dålig.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-513F | _ |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-512F | _ |
Porcine Trypsin 1:250 | BD Difco | 215310 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130 | Solvent: Buffer Solution pH 7.4. Stock concentration: Powder |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | BDH Chemicals-VWR | 10323 | _ |
Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | F6636 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma-Aldrich | 49752 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/ml |
β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate | Sigma-Aldrich | 50020 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 1M |
Insulin. Human Recombinant | Sigma-Aldrich | 91077 | Solvent: NaOH 0.1M. Stock concentration: 10 mM |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 1 mM / 100 µM. Stock in nitrogen liquid to maintain the biological activity |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | _ |
Fetal Bovine Serum South America | EUROCLONE | ECS0180L | _ |
Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/ml | LONZA | DE17-602E | _ |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | 274429 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2% |
Putresceine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T-1147 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/ml |
Human Epidermal Growth Factor (EFGF) | Sigma-Aldrich | E5036 | Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 µg/ml |
Fibroblast Growth Factor-Basic Human | Sigma-Aldrich | F0291 | Solvent: DPBS +0.2% BSA. Stock concentration: 25 µg/ml |
Selenous Acid | Sigma-Aldrich | 211176 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Oil Red O | ICN Biochemicals | 155984 | Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder |
Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt | Sigma-Aldrich | N5000 | Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder |
Fast Blue BB Salt | Sigma-Aldrich | F3378 | Solvent: TrisHCL pH 9.0. Stock concentration: Powder |
Fast Red Violet LB Salt | Sigma-Aldrich | F3381 | Solvent: TrisHCL pH 9.1. Stock concentration: Powder |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | A-4503 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 2% |
Alizarin Red S | ICN Biochemicals | 100375 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 533998 | 4% |
Triton 100X | MERCK | 11869 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Danger_Use only under chemical wood |
Calcein | MERCK | 2315 | Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 µg/ml |
2-Propanol | MERCK | 109634 | Danger_Use only under chemical wood |
Ab-CD105 (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | Abcam | ab11415 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD44 (Mouse monoclonal [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7®) ) | Abcam | ab46793 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD45 (Mouse monoclonal [MEM-28] to CD45 (PerCP)) | Abcam | ab65952 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD105 (Human CD105 Purified Antibody) | Invitrogen | MHCD10500 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-CD44 (Anti-CD44 Antibody) | Abcam | EPR1013Y(ab51037) | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-Stro-1 (Mouse anti-STRO-1) | Invitrogen | 398401 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 488 (Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)) | Invitrogen | A-21206 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)) | Invitrogen | 61-6511 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 635 Phalloidin | Invitrogen | A34054 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
AutoMACS™Running Buffer MACS Separation Buffer | Miltenyi | 130,091,221 | Liquid. Store at 4°C |
QIAzol®Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | Danger_Use only under chemical wood |
QUANTITECT® Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205314 | _ |
Chlorophorm | Sigma-Aldrich | C2432 | Liquid. Danger_Use only under chemical wood |
Laminar flow hood | GELAIRE | BSB6A | _ |
Chemical hood | ARREDI TECNICI Villa | Modello DYNAMICA | _ |
CO₂ incubator | Officine Meccaniche KW | CO2W91 | _ |
Centrifuge | EPPENDORF | 5415R | _ |
Laser Scanning Confocal Microscopy LSM 5109 Meta | ZEISS | _ | _ |
iCycler PCR Thermalcycler | BIORAD | _ | _ |
CyFlow®SPACE | (PARTEC) | _ | _ |
Inverted Micrposcope Axiovert 200M | ZEISS | _ | _ |
Freezing container , | Nalgene | _ | _ |
Original Pipet-Aid | pbiBrand | _ | _ |
Micropipettes | EPPENDORF | _ | _ |
Glass Pasteur Pipette | SIGMA | _ | _ |
VICTOR3™ | PERKIN ELMER | _ | _ |
Conical tubes (15 and 50 mL) | BD FALCON | 352096 (for 15 mL) 352070 (for 50 mL) | _ |
24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | BD FALCON | 353047 | _ |
6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | CORNING | 3471 | _ |
Serological pipettes (5 and 10 mL) | BD FALCON | 357543 (for 5 mL) 357551 (for 10mL) | _ |
Syringe (5mL) | B|BRAUN | 4617053V | _ |
Petri dish 100X20 mm | BD FALCON | 353003 | _ |
Röhren Tubes (3,5 ml, 55x12mm, PS) | SARSTEDT | 55,484 | _ |
Petri dish 60X15 mm | BD FALCON | 353004 | _ |
Cryovials 1.5 ml | NALGENE | 5000-1020 | _ |
Cell CultureFlasks 25 cm² | BD FALCON | 353014 | _ |
Nylon Net Filter, Hydrophilic | MERCK | NY4104700 | _ |
Swinnex Filter Holder | MERCK | SX0002500 | _ |
Perry tweezer | _ | _ | _ |
Lancet | _ | _ | _ |
Dounce | _ | _ | _ |