그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
인플루엔자 A 바이러스 (IAV)는 포락선 바이러스와 오르 쏘 믹소 바이러스과 (orthomixoviridae)의 가족에 속한다. 그 유전자는 세그먼트, 음의 감지 및 단일 가닥 RNA 게놈에 인코딩됩니다. 인간, IAV 계절 전염병의 발생에서 발생하는 호흡기 감염을 원인과 글로벌 전염병 일 가능성을 맺는다. 숙주 세포의 표면에이 시알 산 잔기에 결합하면, IAV는 클라 의존적 세포 내 이입 및 클라 독립 경로 3-8에 의해 내재화된다. 세포 내 이입 공포의 산성 환경 (PH <5.5) 바이러스의 융합과 후반 엔도 좀 막 9 초래 IAV 스파이크 당 단백질 헤 마글 루티 닌 (HA)의 주요 구조적 변화를 트리거합니다. 사이트 오 – IAV 캡시드되면 말 엔도 좀 (레),이 핵에 바이러스 리보 (vRNPs)의 전송 다음 세포질에 코팅되지 않은됩니다에서 탈출했다 (여기 또한 바이러스의 "핵심"이라한다)F 바이러스 복제 및 전사 10-13. HA 산의 활성화에 앞서 바이러스는 연속 14-16 분해 용 코어를 준비하게 이입 시스템에서 pH의 점차적 감소를 경험한다. 이 "프라이밍"양성자와 K +10,14,16의 유입을 매개 바이러스 막 중의 M2 이온 채널 단계. 바이러스 내부에 이온 농도의 변화는 상호 작용이 바이러스의 매트릭스 단백질 (M1)과 여덟 vRNP 번들로 구축 방해 및 막 융합 10,14-17 다음 세포질 IAV의 uncoating을 용이하게한다.
프라이밍 공정 직접 정량 분석은 엔도 좀 실험적 액세스 어렵다는 사실에 의해 저해되었다. 진입 과정은 또한 매우 비동기이다. 또, 릴리스 바이러스 RNA 또는 감염성 측정 QRT-PCR 같은 종점 분석법은 바이러스 capsi의 생화학 적 상태에 대한 상세한 그림을 제공하지항목의 특정 단계 라. siRNA를하거나 약물 치료에 의해 엔도 좀의 교란이 크게 IAV 항목 18 ~ 20의 이해에 기여하고 있지만, 미세 조정은 엄격하게 통제 엔도 좀 성숙 프로그램에서 불특정 부작용에 어렵고 쉽다.
이러한 문제를 방지하기 위해 속도 구배 원심 분리 (17)의 사용에 기초하여 이전에 개발 된 시험 관내 프로토콜을 채택하고있다. 대부분의 단백질 분해 절단 및 EM 분석 하였다 세제 처리의 조합을 기반으로 한 다른 시도가 21, 22, 23, 24, 대조적으로,이 방법은 쉽게 정량화 결과 수 있었다. 다른 구배 층을 통해 원심 분리는 침강 입자에 노출 제어 된 방식으로 상황 변화에 반응 할 수있다. 제시된 프로토콜, IAV 정화 막액 또는 정제 된 바이러스 입자로부터 유도는 2 층 글리세롤로 침강구배하는 바닥층은 비이 온성 세제 NP-40 (도 1)을 포함한다. 바이러스 제 세제 함유층 들어갈 때, 바이러스 외피 지질 및 엔벨로프 당 단백질 부드럽게 가용화 남아있다. 코어 8 개의 vRNP 다발로 구성되며, 매트릭스 층에 의해 둘러싸인 펠렛 분획으로 안정한 구조와 퇴적물. 이러한 M1과 vRNP 관련 핵 단백질 (NP)과 같은 바이러스 코어 단백질은, SDS-PAGE 및 쿠마시 염색으로 펠렛으로 식별 될 수있다. 특히, 시판 구배 겔을 활용하고 고감도 콜로이드 쿠마시 염색 25, 고정밀 바이러스 코어 – 관련 단백질에도 소량의 검출을 가능하게한다.
이는 pH를, 염 농도, 및 추정 uncoating 요인 핵심 구성 요소 및 핵심 STABIL의 침강 거동에 영향을 상이한 조건 여부를 시험하기위한 기준을 설정 성만. 이를 위해, 글리세롤 구배 만 이하, 세제 함유층 인자 또는 관심 조건을 도입함으로써 변경된다. 이 기술은 IAV 코어 (16)의 무결성에 대한 pH 값 염화칼슘 농도 가지의 효과를 조사하고 특히 가치있다. IAV의 uncoating의 중간 단계의 pH 5.5와 낮은 16, 17 (그림 1)에서 vRNP 해리 뒤에 약간 산성 pH (<6.5)에서 매트릭스 층을 포함하는 해리를 모니터링 할 수 있습니다. 후자 단계는 상기 늦은 이입 환경 (16)을 반영 글리세롤 층이 높은 K + 농도의 존재에 의해 개선되었다. 바이러스 코어는 그라데이션을 침전으로서 따라서, 그들은 변화 환경 엔도 좀에서 모방 조건을 경험 하였다. 결과는 세포 생물학 분석에서 도출 된 결과를 보완, 체외에서 바이러스 코어의 단계적 해체했다.
t "> 여기에 제시된 방법은 빠른 활성화 및 IAV의 높은 재현성 분석했다 (X31 및 A / WSN / 33) 및 IBV (B가 리 / 40 /) 산성 pH에 의해 트리거 및 분해뿐만 아니라 K +16,17 증가 uncoating 그것은 생각할 알칼리 pH를 17 노광시의 코어 paramyxovirus. 접근법은 셀 입력시 바이러스 캡시드 구조 캡시드 분해의 생화학 적 특성에 대한 통찰력을 얻기 위해 다른 외피 바이러스에 적용 할 수있다.Protocol
Representative Results
Discussion
바이러스 캡시드는 준 안정 거대 분자 복합체이다. 비리의 어셈블리가 바이러스 게놈의 이입 및 응축을 필요로하지만, 감염의 다음 라운드의 시작이 소형 캡시드 구조의 해체에 따라 달라집니다. 바이러스는 세포 수용체, 보호자, 단백질 분해 효소, 모터 단백질 또는 헬리뿐만 아니라 pH와 이온 스위치 (26, 27)에 의해 제공되는 물리적 인 힘을 포함하는 코팅 – uncoating주기를 제어하는 다양?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시약으로 우리를 제공 요헤이 야마우치와 로버타 만치니 감사합니다. 아 연구소는 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (ITN)에 의해 지원되었다, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 유럽 연구위원회 (ERC) (SINERGIA).
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
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