ढाल centrifugation द्वारा इन्फ्लुएंजा एक वायरस capsids की इन विट्रो disassembly में
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
इन्फ्लुएंजा ए वायरस (IAV) एक छा वायरस है और Orthomyxoviridae के परिवार का है। अपने जीन एक खंडों, नकारात्मक भावना और एकल असहाय आरएनए जीनोम पर इनकोड किया गया है। मनुष्यों में, IAV श्वसन संक्रमण, मौसमी महामारी फैलने में जो घटित कारण बनता है और वैश्विक महामारी 1 के लिए संभावित भालू। मेजबान कोशिका की सतह पर 2 सियालिक एसिड के अवशेष के लिए बाध्य करने पर, IAV क्लैथ्रिन पर निर्भर endocytosis और क्लैथ्रिन स्वतंत्र रास्ते 3-8 से भली भाँति है। अम्लीय वातावरण (पीएच <5.5) endocytic रिक्तिकाएं में IAV कील ग्लाइकोप्रोटीन hemagglutinin (हेक्टेयर), जो वायरल के विलय और देर endosomal झिल्ली 9 में यह परिणाम में एक प्रमुख गठनात्मक परिवर्तन हो सके। एक बार जब IAV कैप्सिड (यहाँ के रूप में भी वायरल "कोर" कहा जाता है) देर endosomes (लेस), यह cytosol नाभिक में वायरल ribonucleoproteins (vRNPs) के परिवहन के द्वारा पीछा में uncoated है से बच गया है – साइट ओएफ वायरस प्रतिकृति और प्रतिलेखन 10-13। हा के एसिड सक्रियण से पहले वायरस endocytic प्रणाली है, जो इसके बाद disassembly 14-16 के लिए कोर primes में पीएच में एक क्रमिक कमी अनुभव करता है। इस "भड़काना" में कदम वायरल झिल्ली में M2 आयन चैनल प्रोटॉन और कश्मीर +10,14,16 की आमद मध्यस्थता। वायरस इंटीरियर में आयनिक एकाग्रता में परिवर्तन परेशान बातचीत वायरल मैट्रिक्स प्रोटीन एम 1 और आठ vRNP बंडल से ऊपर का निर्माण, और झिल्ली संलयन 10,14-17 निम्नलिखित कोशिका द्रव्य में IAV uncoating की सुविधा।
भड़काना कदम के प्रत्यक्ष और मात्रात्मक विश्लेषण तथ्य यह है कि endosomes प्रयोगात्मक उपयोग करने के लिए मुश्किल हो जाता है के द्वारा बाधा उत्पन्न की गई है। प्रवेश प्रक्रिया, इसके अलावा अत्यधिक गैर-तुल्यकालिक है। इसके अलावा, इस तरह के जारी किया वायरल शाही सेना या संक्रामकता माप की QRT- पीसीआर के रूप में अंत बिंदु assays, वायरल capsi के जैव रासायनिक स्थिति के बारे में एक विस्तृत चित्र प्रदान नहीं करतेप्रविष्टि के किसी भी कदम पर घ। जबकि siRNA या नशीली दवाओं के उपचार से endosomes की गड़बड़ी काफी IAV प्रविष्टि 18-20 की समझ के लिए योगदान दिया है, ठीक ट्यूनिंग मुश्किल और कसकर नियंत्रित इंडोसोम परिपक्वता कार्यक्रम में unspecific साइड इफेक्ट का खतरा है।
इन समस्याओं से बचने के लिए, हम एक पहले से विकसित इन विट्रो वेग ढाल centrifugation 17 के उपयोग पर आधारित प्रोटोकॉल ढाल लिया है। अन्य प्रयास 21,22, 23,24, जिनमें से ज्यादातर प्रोटिओलिटिक दरार और डिटर्जेंट उपचार ईएम विश्लेषण के बाद के संयोजन पर आधारित थे के विपरीत, इस दृष्टिकोण एक आसानी से मात्रात्मक परिणाम सक्षम होना चाहिए। विभिन्न परतों के माध्यम से ढाल centrifugation sedimenting कणों के संपर्क में है और एक नियंत्रित तरीके से स्थितियों को बदलने के साथ प्रतिक्रिया करने की अनुमति देता। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, IAV स्पष्ट किया द्रव्य या शुद्ध वायरल कणों से निकाली गई एक दो परत ग्लिसरॉल में sedimented रहे हैंढाल, जिसमें नीचे की परत गैर ईओण डिटर्जेंट एनपी 40 (चित्रा 1) शामिल हैं। वायरस दूसरा, डिटर्जेंट युक्त परत में प्रवेश करती है, वायरल लिपिड लिफाफा और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन धीरे solubilized और पीछे छोड़ दिया जाता है। कोर, आठ vRNP बंडल से बना है और एक मैट्रिक्स परत से घिरा हुआ है, गोली अंश में एक स्थिर संरचना के रूप में तलछट। ऐसे एम 1 और vRNP जुड़े nucleoprotein (एनपी) के रूप में वायरल कोर प्रोटीन, एसडीएस पृष्ठ और Coomassie धुंधला द्वारा गोली में पहचाना जा सकता है। विशेष रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ढाल जैल का लाभ ले रही है और अत्यधिक संवेदनशील कोलाइडयन Coomassie 25 के साथ धुंधला हो जाना, उच्च परिशुद्धता और वायरल कोर जुड़े प्रोटीन की भी थोड़ी मात्रा का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है।
इस तरह के पीएच, नमक एकाग्रता, और ख्यात uncoating कारकों मुख्य घटक और कोर stabil के अवसादन व्यवहार पर प्रभाव पड़ता है के रूप में अलग अलग परिस्थितियों है कि क्या परीक्षण के लिए आधार सेट अल्पसंख्यक। इस उद्देश्य के लिए, ग्लिसरॉल ढाल में केवल कम, डिटर्जेंट युक्त परत कारक या ब्याज की हालत को शुरू करने से संशोधित किया गया है। तकनीक IAV कोर 16 की अखंडता पर अलग पीएच मान और नमक सांद्रता के प्रभाव की जांच में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो गया है। IAV uncoating के मध्यवर्ती कदम हल्का अम्लीय पीएच (<6.5) पीएच 5.5 और कम 16,17 (चित्रा 1) में vRNP हदबंदी के द्वारा पीछा किया पर मैट्रिक्स परत की हदबंदी सहित नजर रखी जा सकती है। उत्तरार्द्ध कदम आगे ग्लिसरॉल परत में उच्च + K एकाग्रता की उपस्थिति द्वारा बढ़ाया गया था, एक देर endocytic माहौल 16 को दर्शाती है। इस प्रकार, के रूप में वायरस और कोर ढाल के माध्यम से sedimented वे एक बदलते परिवेश कि endosomes में mimics की स्थिति का अनुभव किया। परिणाम इन विट्रो में वायरल कोर के एक stepwise disassembly था, कोशिका जीव विज्ञान assays से निकाली गई परिणामों के पूरक।
टी "> यहां प्रस्तुत विधि तेजी से सक्षम है और IAV की अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विश्लेषण (x31 और ए / डब्लूएसएन / 33) और IBV (बी / ली / 40) अम्लीय पीएच से शुरू हो रहा है और कश्मीर +16,17 बढ़ती disassembly के रूप में रूप में अच्छी तरह uncoating क्षारीय पीएच जोखिम 17 पर पैरामिक्सोवायरस कोर की। यह कल्पना है कि दृष्टिकोण अन्य छा वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता सेल प्रवेश के दौरान वायरल capsid संरचना और capsid disassembly के जैव रासायनिक गुणों में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए।Protocol
Representative Results
Discussion
वायरल capsids metastable macromolecular परिसरों हैं। virions की विधानसभा encapsidation और वायरस जीनोम का संक्षेपण की आवश्यकता है, संक्रमण के अगले दौर की दीक्षा इस कॉम्पैक्ट कैप्सिड संरचना के disassembly पर निर्भर करता है। वायरस सेलुलर रिसेप्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अभिकर्मकों के साथ हमें प्रदान करने के लिए Yohei यामाउचि और रोबर्टा मैनसिनी धन्यवाद। एएच प्रयोगशाला मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क (ITN) द्वारा समर्थित किया गया, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी), और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा (Sinergia)।
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. Chapter 47. Fields Virology. , 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -. Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
