Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Influensa A-virus (IAV) er en omhyllet virus og tilhører familien av Orthomyxoviridae. Dens gener er kodet på en segmentert, negativ-sense og enkelt-trådet RNA-genom. Hos mennesker fører IAV luftveisinfeksjoner, som oppstår i sesong epidemiske utbrudd og bærer potensialet for globale pandemier 1. Ved binding til sialsyreresiduer på vertscelleoverflaten 2, er IAV internalisert av clathrin-avhengig endocytose og klatrin-uavhengige veier 3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler utløser en større konformasjonsendring i IAV pigg glykoprotein hemagglutinin (HA), noe som resulterer i sammensmelting av det virale og slutten av det endosomale membran 9. Når IAV kapsid (her også referert til som viral "kjerne") har unnsluppet fra sen endosomer (LES), blir den ubelagte i cytosol, etterfulgt av transport av de virale ribonucleoproteins (vRNPs) inn i kjernen – o områdetf virusreplikasjon og transkripsjon 10-13. Før syreaktivering av HA viruset opplever en gradvis reduksjon i pH-verdien i den endocytiske systemet, som klargjør kjerne for den etterfølgende demontering 14-16. I denne "priming" step M2 ionekanaler i viral membranen megle tilstrømningen av protoner og K +10,14,16. Endringen i ionekonsentrasjonen i viruset indre forstyrrer interaksjoner bygges opp av det virale proteinet matrise M1 og de åtte vRNP bunten, og letter IAV avkapsling i cytoplasma følgende membranfusjon 10,14-17.
Direkte og kvantitativ analyse av grunningstrinn er blitt hemmet av det faktum at endosomer er vanskelig å få tilgang eksperimentelt. Oppføringen prosessen er dessuten svært ikke-synkrone. I tillegg trenger end-point-analyser, slik som QRT-PCR av frigjorte virale RNA eller infektivitet målinger, ikke gir et detaljert bilde om det biokjemiske tilstand av viral capsid på et gitt trinn av oppføring. Mens forstyrrelse av endosomes av siRNA eller medikamentell behandling har i betydelig grad bidratt til forståelsen av IAV oppføring 18-20, finjustering er vanskelig og utsatt for uspesifikke bivirkninger i kontrollert endosomet modning program.
For å unngå disse problemene, har vi tilpasset en tidligere utviklet in vitro protokoll basert på bruk av hastighetsgradienten sentrifugering 17. I motsetning til andre forsøk 21,22, 23,24, som var for det meste basert på kombinasjoner av proteolytisk spaltning og vaskemiddel behandling etterfulgt av EM-analyse, denne tilnærmingen mellom en lett målbar resultat. Sentrifugering gjennom forskjellige graderte lag gjør at sedimenterende partikler å bli utsatt for og reagerer med endrede forhold i en kontrollert måte. I den fremlagte protokoll, IAV avledet fra klaret allantoinvæske eller rensede virale partikler sedimenteres i en to-lags glycerolgradient hvor bunnlaget inneholder det ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 (figur 1). Som viruset kommer inn i andre, vaskemiddel inneholdende lag, blir de virale kappe lipid og konvolutt glykoproteiner forsiktig oppløst og etterlot seg. Kjernen, som består av de åtte vRNP bunt og omgitt av en matrise lag, sedimenter som en stabil struktur inn i pellet fraksjonen. Virale kjerneproteiner, slik som M1 og vRNP-assosiert nukleoprotein (NP), kan identifiseres i pellet ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Spesielt å utnytte kommersielt tilgjengelige gradient gels og farging med den svært følsomme kolloidalt Coomassie 25, gir høy presisjon og påvisning av selv små mengder viruskjerne-assosierte proteiner.
Dette setter grunnlaget for å teste om ulike forhold som pH, saltkonsentrasjon, og antatte avkapsling faktorer har effekter på sedimente oppførselen til kjernekomponenter og kjernen stabil ligheten. For å oppnå dette målet, er bare den nedre, vaskemiddel inneholdende lag i glycerol gradienten modifisert ved innføring av faktor eller tilstanden av interesse. Teknikken har vært spesielt verdifullt i å undersøke virkningen av forskjellige pH-verdier og saltkonsentrasjoner på integriteten til IAV kjerne 16. Mellomliggende trinn av IAV avkapsling kan bli overvåket inkluderer dissosiasjon av matrikslaget i svakt surt pH (<6,5) etterfulgt av vRNP dissosiasjon ved pH 5,5 og lavere 16,17 (figur 1). Det sistnevnte trinn ble ytterligere forbedret ved nærværet av høye K + konsentrasjon i glycerol lag, noe som reflekterer en sen endocytiske miljø 16. Således, som viruset og kjernen sedimentert gjennom graderingen de opplevde en endring miljø som etterligner forholdene i endosomer. Resultatet var en trinnvis demontering av viral kjerne in vitro, sammenfallende resultater avledet fra cellebiologi analyser.
t "> Metoden som presenteres her har gjort det mulig rask og reproduserbar analyse av IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) avkapsling utløst av sur pH og økende K +16,17 samt demontering av paramyksovirus kjerner ved alkalisk pH eksponering 17. det kan tenkes at tilnærmingen kan tilpasses andre kappekledde virus å få innsikt i de biokjemiske egenskaper av viral capsidstruktur og kapsid demontering under celle oppføring.Viral capsids er metastabile makromolekylære komplekser. Selv om montering av virioner krever innkapsling og kondensasjon av virusgenomet, initiering av den neste runde av infeksjon avhenger demontering av denne kompakte kapsid struktur. Virus har utviklet seg til å utnytte ulike cellulære mekanismer for kontroll av belegget-avkapsling syklus, inkludert cellulære reseptorer, anstand, proteolytiske enzymer, fysiske krefter som tilbys av motor proteiner eller heli samt pH og ioniske brytere 26,27. Her beskr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Yohei Yamauchi og Roberta Mancini for å gi oss med reagenser. AH laboratoriet ble støttet av Marie Curie Initial Training Networks (ITN), European Research Council (ERC), og av den sveitsiske National Science Foundation (Sinergia).
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |