In Vitro A desmontagem do vírus influenza A caps�eos por centrifugação em gradiente

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Vírus da Influenza A (IAV) é um vírus envolvido que pertence à família de Orthomyxoviridae. Seus genes são codificados em uma, de sentido negativo e segmentada genoma de ARN de cadeia simples. Nos seres humanos, IAV causa infecções respiratórias, que ocorrem em surtos epidêmicos sazonais e tem o potencial para pandemias globais ^1. Após a ligação de resíduos de ácido siálico na superfície das células de acolhimento ^2, IAV é internalizado por endocitose dependente de clatrina e vias independentes de clatrina ^3-8. O meio ácido (pH <5,5) nos vacúolos de endocitose desencadeia uma mudança conformacional na IAV pico glicoproteína hemaglutinina (HA), o que resulta na fusão do vírus e no final da membrana endossomal ^9. Uma vez que a cápside IAV (aqui também referido como "núcleo" viral) escapou de endossomas tardios (EIE), que é não revestidos no citosol seguido por transporte das ribonucleoproteínas virais (vRNPs) no núcleo – o local de Oa replicação do vírus e transcrição F ^10-13. Antes da activação de ácido HA do vírus sofre uma redução gradual do pH no sistema endocítico, que prepara o núcleo para a sua desmontagem posterior ^14-16. Neste "priming" intensificar os canais de íon M2 na membrana viral mediar o influxo de prótons e K ^+10,14,16. A mudança na concentração iônica no interior vírus perturba as interações construir pela proteína da matriz viral M1 ea vRNP pacote de oito, e facilita IAV uncoating no citoplasma seguindo a fusão da membrana ^10,14-17.

análise directa e quantitativa do passo de iniciação tem sido dificultada pelo facto de endossomas são difíceis de aceder experimentalmente. O processo de entrada é, aliás, altamente não-síncrona. Além disso, ensaios de ponto final, como qRT-PCR de RNA ou da infecciosidade medições virais libertados, não fornecem uma imagem detalhada sobre o estado bioquímico do capsi virald em qualquer etapa de entrada. Enquanto perturbação da endossomas por siRNA ou tratamento de drogas tem contribuído significativamente para a compreensão de entrada IAV ^18-20, ajuste fino é difícil e propenso a efeitos colaterais não específicos no programa endosome maturação rigidamente controlado.

Para evitar estes problemas, nós adaptamos um protocolo previamente desenvolvido in vitro, com base na utilização de centrifugação em gradiente de velocidade de ^17. Em contraste com outras tentativas ^{21,22, 23,24,} que eram na maior parte baseados em combinações de clivagem proteolítica e tratamento com detergente, seguido por análise de EM, esta abordagem permitiu um resultado facilmente quantificáveis. Centrifugação através de diferentes camadas de gradiente permite que as partículas sedimentam a ser expostos e reagem com mudança de condições, de forma controlada. No protocolo apresentado, IAV derivados a partir de fluido alantóico clarificado ou partículas virais purificadas são sedimentadas numa glicerol de duas camadasgradiente em que a camada inferior contém o detergente não-iónico NP-40 (Figura 1). Tal como o vírus entra na segunda camada, contendo detergente, o envelope lipídico e glicoproteínas do envelope viral são suavemente solubilizada e deixado para trás. O núcleo, composto pelo feixe vRNP e oito rodeado por uma camada de matriz, sedimentos como uma estrutura estável na fracção de sedimento. proteínas de núcleo virai, tais como M1 e nucleoproteína vRNP-associado (NP), pode ser identificado no sedimento por SDS-PAGE e coloração com Coomassie. Em particular, tomando vantagem de géis de gradiente disponíveis comercialmente e a coloração com Coomassie coloidal altamente sensível ^25, permite alta precisão e a detecção de mesmo pequenas quantidades de proteínas associadas ao núcleo virai.

Isso define a base para testar se condições diferentes, como pH, concentração de sal, e os fatores não revestidos putativos têm efeitos sobre o comportamento de sedimentação dos componentes do núcleo e stabil núcleo dade. Para este objectivo, apenas a camada inferior, contendo o detergente em o gradiente de glicerol é modificado através da introdução do factor ou condição de interesse. A técnica tem sido particularmente útil em investigar o efeito de diferentes valores de pH e concentrações de sal sobre a integridade do núcleo ¹⁶ IAV. Etapas intermediárias de IAV desencapsulamento poderia ser monitorada incluindo dissociação da camada de matriz a um pH ligeiramente ácido (<6,5), seguido de vRNP de dissociação a pH 5,5 e inferior ^16,17 (Figura 1). O último passo foi adicionalmente reforçada pela presença de alta concentração de K ⁺ na camada de glicerol, reflectindo um ambiente endocítica final ^16. Assim, como o vírus e o núcleo sedimentado através do gradiente que experimentaram uma mudança de meio, imitando as condições em endossomas. O resultado foi uma desmontagem gradual do núcleo virai in vitro, completando os resultados derivados a partir de ensaios de biologia celular.

t "> O método aqui apresentado, permitiu rápido e altamente reprodutível análise de IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) desencapsulamento desencadeada pelo pH ácido e aumentando ^+16,17 K, bem como desmontagem de núcleos paramixovírus após exposição pH alcalino ^17. é concebível que a abordagem pode ser adaptada para outros vírus com envelope para obter insights sobre as propriedades bioquímicas da estrutura da cápside virai e desmontagem da cápside durante a entrada na célula.

Protocol

1. Preparação de tampões e soluções de Stock Preparar tampão de MNT (MES 20 mM, Tris 30 mM e NaCl 100 mM) por dissolução de 470 mg de Tris, cloridrato de 390 mg de hidrato de MES e 580 mg de NaCl em 80 ml ​​de ddH 2 O. Ajustar o tampão a pH 7,4 e trazê-lo para um volume final de 100 ml com ddH 2 O. Preparar três soluções idênticas de tampão 500 mM MES dissolvendo 9,76 g MES hidratado em 80 ml ​​de dH2O cada um. Ajustar as memórias intermédias…

Representative Results

Como já foi discutido, priming em endossomos é necessária para tornar o núcleo IAV perda do revestimento competente. A protonação do núcleo enfraquece interacção de M1 e vRNPs (composto do RNA viral, NP, e o complexo de polimerase PB1 / PB2 / PA). Este processo inicia-se quando o vírus de entrada está exposta a um pH de 6.5 (ou inferior) em endossomas precoces (EES) e continua até que os fusíveis de vírus em torno de pH 5,0 em les. <p class="jove_content" fo:keep-togeth…

Discussion

cápsides virais são complexos macromoleculares metaestáveis. Enquanto a montagem de viriões requer a encapsidação e condensação do genoma do vírus, o início da próxima ronda de infecção depende de desmontagem desta estrutura capsídeo compacto. Vírus evoluíram para explorar vários mecanismos celulares para controlar o ciclo de revestimento-desencapsulamento, incluindo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, forças físicas proporcionadas pelas proteínas do motor ou helicases, bem como…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C