In Vitro разборке вируса гриппа капсиды по градиентное центрифугирование

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Вирус гриппа А (ИФО) является оболочечный вирус и принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Его гены кодируют на сегментированных отрицательного смысла и одноцепочечной РНК-генома. У людей, IAV вызывает респираторные инфекции, которые происходят в сезонных вспышек эпидемии и несет потенциал для глобальных пандемий ^1. После связывания с остатками сиаловой кислоты на поверхности клетки – хозяина ^2, ИФО интернализируется в клатрин-зависимой эндоцитоза и клатриновых-независимых путей ^3-8. Кислая среда (рН <5,5) в эндоцитических вакуолей вызывает значительное конформационные изменения в IAV спайка гликопротеина гемагглютинина (HA), что приводит к слиянию вирусной и поздней эндосомальной мембраны ^9. После того, как капсида IAV (здесь также упоминается как вирусный "ядро") сбежал из поздних эндосом (LES), она не покрытом в цитозоле с последующим транспортом вирусных рибонуклеопротеинов (vRNPs) в ядро ​​- сайт Oрепликация вируса F и транскрипции ^10-13. До активации кислотой HA вируса испытывает постепенное снижение рН в системе эндоцитоза, что простые числа ядро для последующей его разборки ^14-16. В этой "затравки" шаг ионных каналов М2 в вирусной мембране опосредуют приток протонов и K ^+10,14,16. Изменение концентрации ионов в интерьере вируса нарушает взаимодействие создать с помощью вирусного белка матрицы M1 и vRNP пучка восемь, и способствует Iav декапсидацию в цитоплазме следующего слияния мембран ^10,14-17.

Прямой и количественный анализ на стадии грунтовочного было затруднено тем, что эндосомы трудно экспериментально получить доступ. Процесс входа, кроме того, весьма несинхронное. Кроме того, конечной точки анализы, такие как QRT-PCR высвобождаемых измерения вирусной РНК или инфекционности, не дают детальное представление о биохимическом состоянии вирусного capsiг при любом данном этапе записи. В то время как возмущение эндосомы, миРНК или медикаментозного лечения в значительной степени способствовало пониманию IAV записи ^18-20, тонкая настройка трудно и склонны к неспецифических побочных эффектов в строго контролируемой программе эндосомы созревания.

Чтобы избежать этих проблем, мы адаптировали ранее разработанный протокол в пробирке , основанный на использовании градиента скорости центрифугирования ^17. В отличие от других попыток ^{21,22, 23,24,} которые были в основном на основе комбинации протеолитического расщепления и обработки детергентом с последующим анализом EM, этот подход позволил в легко измеримый результат. Центрифугирование через различные слои градиента позволяет осаждающихся частиц, которые будут подвергаться воздействию и реагировать с изменением условий контролируемым образом. В представленном протоколе, ИФО полученный из осветленного аллантоисной жидкости или очищенных вирусных частиц осаждают в двухслойную глицерина вградиент , в котором нижний слой содержит неионогенный детергент NP-40 (рисунок 1). По мере того как вирус входит во вторую, детергентов слой, содержащий, вирусные липидной оболочки и гликопротеины оболочки мягко солюбилизировали и оставили позади. Ядро, состоящий из восьми vRNP пучка и окружены матричным слоем, отложения в качестве стабильной структуры в гранулированной фракции. Вирусные основные белки, такие как M1 и vRNP-ассоциированной нуклеопротеида (NP), могут быть идентифицированы в осадке с помощью SDS-PAGE и окрашиванием Кумасси. В частности, пользуясь имеющимися в продаже градиентном геле и окрашиванием с высокочувствительным коллоидного кумасси ^25, обеспечивает высокую точность и обнаружение даже небольших количеств вирусных ядро-ассоциированных белков.

Это закладывает основу для тестирования является ли различных условий, таких как рН, концентрации соли и предполагаемых раздевания факторов оказывают влияние на поведение оседания основных компонентов и ядра Stabil ность. Для этой цели, только нижний, моющее средство слой, содержащий в градиенте глицерина модифицирован путем введения фактора или состояния интереса. Техника была особенно ценным при исследовании влияния различных значений рН и концентрации солей на целостность ядра IAV ^16. Промежуточные этапы IAV раздевания можно было бы контролировать в том числе диссоциации матричного слоя при слегка кислом рН (<6,5) с последующим vRNP диссоциации при рН 5,5 и ниже ^16,17 (рисунок 1). Последний шаг был еще более усиливается наличием высокой концентрации К ⁺ в глицериновый слой, отражающий поздний эндоцитических среду ^16. Таким образом, как вирус и ядро ​​осаждали через градиент они испытали изменяющуюся среду, которая имитирует условия в эндосомы. Результатом стала поэтапная разборка вирусного ядра в пробирке, дополняя результаты , полученные из клеточной биологии анализов.

т "> Метод , представленный здесь , позволило быстро и легко воспроизводимым анализ IAV (X31 и A / WSN / 33) и IBV (B / Lee / 40) раздевания вызвано кислом рН и увеличение K ^+16,17, а также разборки из парамиксовирусной сердечников при воздействии ¹⁷ щелочном рН. можно предположить , что этот подход может быть адаптирован к другим оболочечных вирусов , чтобы получить представление о биохимических свойств вирусного капсида и структуры капсида разборки во время ввода данных в ячейку.

Protocol

1. Подготовка буферами и маточные растворы Подготовка MNT буфера (20 мМ MES, 30 мМ Трис и 100 мМ NaCl) при растворении 470 мг трис – гидрохлорида, 390 мг MES гидрата и 580 мг NaCl в 80 мл DDH 2 O. Настройка буфера до рН 7,4 , и довести его до конечного объема 100 мл с DDH 2 O. Подготовьте три идентич?…

Representative Results

Как уже говорилось, грунт в эндосомами требуется, чтобы сделать ядро ​​Iav раздевания компетентным. Известно, что протонирование ядра ослабляет взаимодействие М1 и vRNPs (в составе вирусной РНК, NP, и полимераза PB1 / PB2 / ПА). Этот процесс начинается, когда входящий вирус подв?…

Discussion

Вирусные капсиды являются метастабильными макромолекулярных комплексов. В то время как сборка вирионов требует капсидирования и конденсацию генома вируса, начало следующего раунда инфекции зависит от разборки этой компактной конструкции капсида. Вирусы развились , чтобы использова…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C