Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Influensa A-virus (IAV) är ett höljevirus och tillhör familjen Orthomyxoviridae. Dess gener kodas på en segmenterad, negativ-sense och enkelsträngat RNA-genomet. Hos människor orsakar IAV luftvägsinfektioner, som förekommer i säsong utbrott epidemiska och bär risken för globala pandemier 1. Vid bindning till sialinsyrarester på värdcellytan 2, är IAV internaliseras av clathrin-beroende endocytos och clathrin oberoende vägar 3-8. Den sura miljö (pH <5,5) i de endocytiska vakuoler utlöser en stor konformationsförändring i IAV spik glykoprotein hemagglutinin (HA), vilket resulterar i fusion av det virala och den sena endosomala membranet 9. När väl IAV kapsiden (här även hänvisad till som viral "kärna") har undkommit från sena endosomer (LES), är det inte belagda i cytosolen följt av transport av de virala ribonukleoproteiner (vRNPs) in i kärnan – platsen of virusreplikation och transkription 10-13. Innan syraaktivering av HA viruset upplever en gradvis minskning av pH i den endocytiska systemet, som primär kärnan för dess efterföljande demontering 14-16. I denna "priming" steg M2 jonkanaler i virusmembranet mediera tillströmningen av protoner och K +10,14,16. Förändringen i jonkoncentration i virus inre stör samspelet bygga upp av den virala matrisprotein M1 och åtta vRNP bunten, och underlättar IAV uncoating i cytoplasman efter membranfusion 10,14-17.
Direkt och kvantitativ analys av evakueringssteget har hindrats av det faktum att endosomer är svåra att komma åt experimentellt. Inmatningsprocessen är för övrigt i hög grad icke-synkron. Dessutom har end-point-analyser, såsom QRT-PCR av frigjorda virala RNA eller infektions mätningar, inte ge en detaljerad bild av den biokemiska tillstånd virala Capsid vid varje givet steg av posten. Även störning av endosomer av siRNA eller läkemedelsbehandling har väsentligt bidragit till förståelsen av IAV inträde 18-20,-tuning bra är svårt och benägna att ospecifika biverkningar i hårt kontrollerad endosomen mognad program.
För att undvika dessa problem, har vi anpassat en tidigare utvecklad in vitro-protokoll baserat på användningen av hastighets gradientcentrifugering 17. Till skillnad från andra försök 21,22, 23,24, som oftast var baserade på kombinationer av proteolytisk klyvning och tvättmedel behandling följt av EM analys, detta tillvägagångssätt möjliggjorde en lätt mätbar resultat. Centrifugering genom olika lutning lager tillåter sedimente partiklarna att utsättas för och reagera med förändrade förutsättningar på ett kontrollerat sätt. I den presenterade protokollet, IAV härrörande från klar allantoisvätska eller renade virala partiklar sedimenteras till en två-lagers glycerolgradient i vilken det undre lagret innehåller den icke-joniska detergenten NP-40 (Figur 1). Eftersom viruset kommer in i andra, tvättmedel som innehåller lager, de virus lipid kuvert och kuvert glykoproteiner försiktigt solubiliseras och kvar. Kärnan, som består av den åtta vRNP knippet och omgiven av ett matrisskikt, sediment som en stabil struktur in i pelletfraktionen. Virala kärnproteiner, till exempel M1 och vRNP-associerad nukleoprotein (NP), kan identifieras i pelleten med SDS-PAGE och Coomassie-färgning. I synnerhet dra nytta av kommersiellt tillgängliga gradientgeler och färgning med den mycket känsliga kolloidalt Coomassie 25, möjliggör hög precision och detektion av även små mängder av viruskärn associerade proteiner.
Detta utgör grunden för att testa om olika förhållanden såsom pH, saltkoncentration, och förmodade uncoating faktorer har effekter på sedimenteringsbeteende kärnkomponenter och kärn stabil heten. För detta syfte, är endast den nedre, detergent-innehållande skikt i glycerolgradient modifieras genom införande av faktorn eller ett tillstånd av intresse. Tekniken har varit särskilt värdefullt att utreda effekten av olika pH-värden och saltkoncentrationer på integritet IAV kärnan 16. Mellanliggande steg av IAV uncoating kunde övervakas inkluderande dissociation av matrisskiktet vid milt surt pH (<6,5) följt av vRNP dissociation vid pH 5,5 och lägre 16,17 (Figur 1). Det senare steget förstärktes ytterligare genom närvaron av hög K + koncentration i glycerolskiktet, vilket återspeglar en sen endocytiska miljö 16. Således, eftersom viruset och kärnan sedimente genom gradienten de upplevde en föränderlig miljö som efterliknar förhållandena i endosomer. Resultatet var en stegvis demontering av den virala kärnan in vitro komplement resultat som härrör från cellbiologiska analyser.
t "> Den metod som presenteras här har möjliggjort snabb och mycket reproducerbar analys av IAV (X31 och A / WSN / 33) och IBV (B / Lee / 40) uncoating utlöses av surt pH och öka K +16,17 samt demontering av paramyxovirus kärnor vid alkaliskt pH exponering 17. det är tänkbart att tillvägagångssättet kan anpassas till andra inkapslade virus att få insikt i de biokemiska egenskaperna hos den virala kapsiden struktur och kapsiden demontering under cellinträde.Virala kapsider är metastabila makromolekylära komplex. Även montering av virioner kräver inkapsling och kondensering av virusgenomet, inledningen av nästa omgång av infektion beror på demontering av denna kompakta kapsid struktur. Virus har utvecklats till att utnyttja olika cellulära mekanismer för att styra beläggnings uncoating cykel, inklusive cellulära receptorer, chaperones, proteolytiska enzymer, fysiska krafter som tillhandahålls av motorproteiner eller helikaser samt pH och joniska omkopplare …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Yohei Yamauchi och Roberta Mancini för att förse oss med reagens. AH laboratorium stöddes av Marie Curie Initial Training Networks (ITN), European Research Council (ERC) och av den schweiziska National Science Foundation (Sinergia).
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |