Gradient Santrifüj tarafından İnfluenza A Virüsü Kapsidlerin Vitro Demontaj içinde
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
İnfluenza A virüsü (IAV) zarflı bir virüstür ve Ortomiksoviridae ailesine aittir. Bu genler, parça parça, negatif sens, tek iplikçikli bir RNA genomu üzerindeki kodlanır. İnsanlarda, IAV mevsimsel salgın salgınlar meydana solunum yolu enfeksiyonları, nedenleri ve küresel salgın hastalıklar 1 potansiyelini taşımaktadır. Ev sahibi hücre yüzeyi 2 sialik asit artıkları bağlanma üzerine, IAV klatrin bağlı endositoz ve klatrin bağımsız yollar 3-8 ile yerleştirilebilir. Endositik vakuollerde asidik ortam (pH <5.5), viral füzyonu ve geç endosomal zarı 9 sonuçlanır IAV başak glikoprotein hemaglutinin (HA), büyük bir yapısal değişim tetikler. Site o – IAV kapsid kez geç endosomes (LES), bu çekirdeğin içine viral ribonükleoproteinlerin (vRNPs) taşınması ve ardından sitozolde kaplanmamış olan kaçan (burada da viral "çekirdek" olarak anılacaktır)f virüs replikasyonu ve transkripsiyonu 10-13. HA asit aktivasyonu öncesinde virüs ileride bunun demontajı 14-16 çekirdek hazırlar endositik sistemi, pH tedrici bir azalma yaşar. Bu "priming" proton ve K +10,14,16 akını aracılık viral membran M2 iyon kanallarını adım. Virüs iç iyonik konsantrasyon değişim etkileşimleri, viral matriks protein M1 ve sekiz vRNP demet tarafından inşa rahatsız ve membran füzyon 10,14-17 aşağıdaki sitoplazmada IAV olmama kolaylaştırır.
hazırlama aşamasında doğrudan ve kantitatif analiz endozomlar deneysel ulaşılması zor olduğu gerçeği engel olmuştur. giriş süreci, dahası, son derece olmayan eşzamanlı olduğunu. Buna ek olarak, bu tür serbest viral RNA veya enfekte ölçümlerinin QRT-PCR gibi son nokta tahlilleri, viral capsi biyokimyasal durumu hakkında detaylı bir resmini sağlamazgiriş herhangi bir aşamasında, d. SiRNA veya ilaç tedavisi ile endozomlardan pertürbasyon anlamlı IAV girişi 18-20 anlayışına katkıda bulunurken, ince ayar sıkı kontrol endosome olgunlaşma programında belirsiz yan etkileri zor ve eğilimli.
Bu sorunları önlemek için, hız gradyanı ile santrifüjleme 17 kullanımına dayanmaktadır, daha önce geliştirilmiş in vitro protokol adapte edilmiştir. Çoğunlukla proteolitik bölünme EM analizi ile izlenmiştir deterjan muamelesi kombinasyonları dayanmaktadır diğer girişimlerde 21,22, 23,24, aksine, bu yaklaşım kolayca ölçülebilir bir sonuç sağladı. Farklı gradyan katmanları üzerinden Santrifüj çöktürülmesi parçacıklar maruz bırakılmış ve kontrollü bir şekilde değişen koşullara reaksiyona sağlar. Sunulan protokol olarak, IAV açıklık allantoik akışkan ya da saflaştınlmış viral parçacıkların elde edilen iki tabakalı bir gliserine çöktürülürgradyan olup, buradaki alt tabaka, iyonik olmayan bir deterjan NP-40 (Şekil 1) içerir. Virüs, ikinci deterjan içeren katmanı girdiğinde, viral lipid zarfı ve zarf glikoproteinleri yavaşça çözülmüş ve geride bırakılır. çekirdek, sekiz vRNP demet oluşan ve bir matris tabakasıyla çevrili, pelet fraksiyonu içine kararlı bir yapı olarak çökelleri. M1 ve vRNP ilişkili nükleoprotein (NP) ve viral çekirdek proteinleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile pelet içinde tespit edilebilir. Özel olarak, ticari olarak temin edilebilen gradyan jelleri yararlanarak ve son derece hassas Coomassie 25 ile boyama, yüksek hassasiyet ve viral çekirdek ilişkili proteinlerin küçük miktarlarda bile tespitini sağlar.
Bu pH, tuz konsantrasyonu ve varsayılan kılıfının faktörler temel bileşenleri ve çekirdek stabil ve sedimantasyon davranışları üzerindeki etkileri gibi farklı koşullar olup olmadığını test etmek için temel ayarlar Sığ. Bu amaç için, gliserol geçişi olarak sadece düşük, deterjan içeren katman faktörü ya da ilgi duyulan durum girerek modifiye edilir. Teknik IAV çekirdek 16 bütünlüğüne pH değerleri ve tuz konsantrasyonları farklı etkisini araştıran özellikle değerli olmuştur. IAV olmama arasında ara adımlar pH 5.5 ve daha düşük 16,17 (Şekil 1) vRNP ayrışma ardından hafif asidik pH'ta (<6.5) matris tabakasının dahil olmak üzere ayrılmasını takip edilebilir. Ikinci adım geç endositik ortamı 16 yansıtan gliserol tabakasında yüksek K + konsantrasyonu varlığında tarafından geliştirilmiştir. Virüs ve çekirdek degrade ile tortulaşmış Böylece, onlar bir değişen ortam endosemelerde taklit koşullar yaşadı. Sonuç hücre biyolojisi deneyleri türetilen sonuçları tamamlayan, in vitro viral çekirdek kademeli sökme oldu.
t "> Burada sunulan yöntem, hızlı etkin ve IAV son derece tekrarlanabilir analiz etti (X31 ve A / KAA / 33) ve IBV (B Lee / 40 /) asidik pH ile tetiklenir ve demontaj yanı sıra K +16,17 artan olmama Bu düşünülebilir alkali pH maruz 17 üzerine paramiksovirüs çekirdeklerin. yaklaşım hücre girişi sırasında viral kapsid yapısı ve kapsid sökme biyokimyasal özellikleri içgörü kazanmak için diğer zarflı virüsler adapte edilebilir.Protocol
Representative Results
Discussion
Viral kapsidler metastabil makromoleküler kompleksler bulunmaktadır. virionlar montaj virüs genomunun encapsidation ve yoğunlaşmayı gerektirir, enfeksiyon sonraki turda başlanması bu kompakt kapsid yapısının sökülmesi bağlıdır. Virüsler hücresel reseptörler, şaperonlar, proteolitik enzim, motor protein ve helikazlar yanı sıra pH ve iyonik anahtarları 26,27 tarafından sağlanan fiziksel kuvvetler de dahil olmak üzere kılıf kılıfının döngüsü kontrol etmek için çeşitli hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz reaktif bize sağlamış Yohei Yamauchi ve Roberta Mancini teşekkür ederiz. AH laboratuvar Marie Curie ilk Eğitim Ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Sinergia).
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. Chapter 47. Fields Virology. , 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -. Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
