배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

요약

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

초록

혈관 평활근 세포(VSMC)의 근 소포체(SR)에서 정상 상태 칼슘(Ca²⁺) 수준을 유지하는 것은 전반적인 건강에 매우 중요합니다. 세포 내 Ca²⁺ 함량의 상당 부분은 VSMC의 SR 저장소 내에서 발견됩니다. 원형질막-SR 접합을 통해 주변 세포외 공간과 밀접한 연관을 가진 유일한 세포 내 소기관인 SR은 Ca²⁺ 과도 상태 또는 세포가 경험하는 스트레스의 불규칙성에 대한 첫 번째 반응 라인을 구성하는 것으로 간주될 수 있습니다. 많은 기능 중 가장 중요한 기능 중 하나는 세포 전체에 걸쳐 Ca²⁺ 조절 신호를 전송하여 세포 전체의 추가 반응을 유도하는 역할입니다. 이와 관련하여 세포질 Ca²⁺ 지표의 보다 일반적인 사용은 아직 완전히 특성화되지 않은 내강 내 SR Ca²⁺ 저장에 대한 매우 역동적인 변화에 대한 연구에 전반적으로 충분하지 않습니다. 여기에서는 luminal SR Ca²⁺의 직접적이고 명확한 측정을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 도구는 세포의 정상적인 기능과 건강에 중대한 영향을 미치는 SR Ca²⁺의 미묘한 변화를 조사하는 데 유용합니다. 특히 SR Ca²⁺ 함량의 변동은 세포가 경험하는 질병 또는 스트레스 상태에 대한 세포 반응과 관련된 상당한 양의 정보를 제공할 수 있습니다. 이 방법에서는 SR 표적 Ca²⁺ 지시약의 수정된 버전인 D1SR을 사용하여 배양된 쥐 대동맥 평활근 세포(SMC)에 제제를 도입한 것에 대한 반응으로 Ca²⁺ 변동을 감지합니다. D1SR 지시자를 사용한 배양 후 컨포칼 형광 현미경 검사 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기반 이미징을 사용하여 제어 조건 하에서 내강 내 SR Ca²⁺ 수준의 변화를 직접 관찰하고 세포 내 Ca²⁺ 이동을 유도하는 기능을 하는 작용제를 추가합니다.

서론

^칼슘은 신체의 모든 단일 세포 내에서 풍부하게 발견되는 매우 중요한 이온입니다. 그것은 성장, 증식, 이동 및 세포 사멸 ^1-4 등 다양한 세포 기능에 중요한 역할을 가지고있다. 잘 ^칼슘이 모두 직간접적인 행동을 통해 이러한 프로세스에 영향을 미칠 수 있음을 설립, 따라서,이 이온의 정상적인 세포 내 농도 변화는 쉽게 영향을받는 세포에 대한 부정적인 결과가 발생할 수 있습니다. 스케줄링은 셀 ⁽⁵⁾ 내에서 가장 큰 세포 내 ^칼슘 저장소로 간주됩니다. 스케줄링 및 세포질 모두에서 ^칼슘의 정상 상태 수준은 일반적으로이 세포 기관의 ^칼슘 수송성 채널 중 일정한 유량을 통해 유지된다. 인한 부상 또는 질병의 형태로 세포에 가해지는 스트레스 조건은 일반적으로 그가 온 오래 지속되는 효과를 가지고 갈 SR 칼슘의 중요한 변화 ^2+와 관련된셀의 alth. 케이스의 가장 심각한에서 스트레스 셀의 무능력 복구하고 정상 상태 SR의 칼슘을 유지 ²⁺ 수준도 사멸 ^6-8으로 사망 절정에 달하다 수 있습니다.

세포의 ^칼슘 역학에 대한 현재의 연구는....

프로토콜

윤리 문 : 모든 실험과 절차는 브리티시 컬럼비아 주, 밴쿠버, 캐나다의 대학의 연구소 바이오 안전성 가이드 라인과 일치 실시 하였다.

FRET 기반 공 초점 현미경을위한 35mm 유리 바닥 문화 요리 1. 준비

1. 다음 절차에 따라 36-48 시간 전에 실험에를 사용하여 플레이트를 준비합니다.
2. C 저장 ° -20에서 선택 젤라틴 단백질 혼합물 0.25 % 트립신 EDTA를 검색하고 사용할 때까지 이동 얼음 욕조에 보관하십시오.
   주 : 단백질이 코팅 혼합물만을 사용 전에 고화 혼합을 방지하기 위해, 짧은 시간 동안 RT에 노출되어야한다. 필요할 때까지 트립신 용액은 냉장 보관한다; 대안으로, 트립신 단계 1.5 완료 후 -20 ° C 저장 영역에서 검색 할 수 있습니다.
3. DMEM (더 추가 된 혈청, 냉장) : 단백질 혼합물의 1시 25분 희석을 준비합니다. 각 플레이트가 준비되기 단백질 혼합물 / DMEM의 적절한 볼륨을 이동. 35mm 유리 바닥 판의 경우, 완전 판의 하단에 내부 유리 원을 충당하기 위해 약 200 μl를 추가합니다.
4. 안전 캐비닛 내부 및 실온에서 적어도 30 분 동안 앉아 접시를 남겨주세요. 이 기간 동안 물을 욕조에 37 ° C 10 % NCS와 따뜻한 DMEM.

결과

이 섹션은 간접적 세포질 칼슘의 변동을 관찰함으로써 ^칼슘 저장소 농도 소기관하는 변화를 측정 통상 사용되고있는 방법에 비해, SR 내강 ^칼슘 농도 데이터를 캡처하는 한 방법을 사용하여 얻을 수있는 결과의 예를 제공 ²⁺ .

도 1a는 YFP 채널 (514 nm의 여기 / 535 nm의 방출)에 D1SR 아데노 바이러스로 형질 SMC 문화의 관심 (ROI)의 영역의 스냅 샷을 보여줍니다. 모든 SMCs가 D1SR 발현 양성되지만, 도시 된 바와 같이,이 D1SR 표시기 발현 수준이 동일한 ROI 내의 다른 셀 사이에서 변화하는 것이 분명하다.도 1b는 D1SR로 형질 SMC의 형광 화상의 2-D 투사를 도시 ^칼슘 분포의 명확.......

토론

이 프로토콜은 SR의 루멘 내 ^칼슘 농도를 연구하기 D1SR 아데노 바이러스와 혈관 평활근 세포의 형질을 설명합니다. 이 방법은 직접이 소기관 내 ^칼슘의 측정뿐만 아니라 다른 칼슘 이동 에이전트 애플리케이션의 결과로서 SR 만점으로의 이동 / 허용한다. 이 방법은 SR과 세포질 ^칼슘 수준에 변화가 전체 세포의 건강에 영향을 미칠 어떻게 이러한 변화는 상호 관련있는 방법의 포괄적 인 이해를 위해 노력 연구자를위한 많은 장점을 가지고있다. 세포 내 ^칼슘 운동의 전통 관찰은 세포질 ^칼슘 수준 변화의 추적을 포함한다. D1SR하거나 유사한 구조를 이용하여 유래의 중요한 장점은 따라서, 오히려 SR에 대한 아고 니스트의 효과에 의해 모호한 결론을 도출 할 필요없이, 예를 들면 SR 같은 특정 소기관을 포함하는이 이온의 움직임을 모니터 할 수있다간접적 조작에 의해 유도 된 세포 내 ^칼슘 수준의 변화를 관찰. 같은 맥락 함.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 변형 된 독수리의 매체 (고 포도당, 피루 베이트)	생명 기술	11995-065	37 °에서 따뜻한; 사용 전 C 수조
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml	Corning	356230	-20도로 유지 & C 사용 직전까지
신생아 송아지 세럼	시그마-알드리치		-20 유지 ° C 사용 직전까지
35mm 유리 바닥 플레이트	MatTek Corporation	P35G - 1.5 - 14 - C
250ml 0.2 μ M 통풍 블루 플러그 씰 캡 플라스크	BD 팔콘	353136
트립신/EDTA 솔루션	생명 기술	25200056	-20 ° C 사용 직전까지
50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	선물
디메틸 설폭시드 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	-20 ° C 사용 직전까지
1.5ml 블랙 마이크로원심분리기 튜브	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5 컨포칼 현미경	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.