Ekstracellulær Registrering af neuronal aktivitet Kombineret med Microiontophoretic Anvendelse af Neuroaktive stoffer i Awake mus

Summary

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

Abstract

Forskelle i aktiviteten af ​​neurotransmittere og neuromodulatorer og dermed forskellige neurale reaktioner, kan findes mellem bedøvede og vågen dyr. Derfor er fremgangsmåder, der tillader manipulation af synaptiske systemer i vågne dyr kræves for at bestemme bidraget af synaptiske input til neuronal forarbejdning upåvirket af anæstetika. Her præsenteres metode til opførelse af elektroder til samtidig optage ekstracellulær neurale aktivitet og frigive flere neuroaktive stoffer i nærheden af ​​optagelsen steder i vågen mus. Ved at kombinere disse procedurer, udførte vi microiontophoretic injektioner af gabazine til selektivt at blokere _{GABAA-receptorer} i neuroner i den inferiore colliculus af hoved-behersket mus. Gabazine held modificeret neurale respons egenskaber, såsom frekvensgang område og stimulus-specifik tilpasning. Således viser vi, at vores metoder er egnede til recording enkelt enhed aktivitet og for dissecting rolle specifikke neurotransmitterreceptorer i auditive forarbejdning.

Den væsentligste begrænsning af den beskrevne procedure er den relativt korte optagetiden (~ 3 timer), som er bestemt af niveauet af tilvænning af dyret til indspilningerne. På den anden side kan flere indspilningssessioner udføres i det samme dyr. Fordelen ved denne teknik i forhold til andre eksperimentelle procedurer, der anvendes til at manipulere niveauet af neurotransmission eller neuromodulation (såsom systemiske injektioner eller anvendelsen af ​​optogenetic modeller), er, at lægemidlet effekten er begrænset til de lokale synaptiske input til mål-neuron. Derudover custom-fremstilling af elektroder giver mulighed for justering af specifikke parametre ifølge den neurale struktur og type neuron af interesse (såsom spidsen modstand til forbedring af signal-støjforholdet af optagelserne).

Introduction

Samspillet mellem neural excitation og hæmning er fundamental for behandling af sensorisk information ^1. Det er også kendt, at anæstesi har en stærk indflydelse på dynamikken i cortical aktivering og den tidsmæssige mønster af synaptiske input ^2,3. For eksempel er det blevet observeret, at anæstetika ændre varigheden af visuelt fremkaldte reaktioner i corticale neuroner ^3,4. Desuden er forholdet mellem stimulerende og hæmmende synaptiske input er forskellig i bedøvede og vågne dyr ^4,5, ændre både fremkaldte og spontane erhvervsfrekvens ^6,7. Ved at måle de synaptiske konduktanser, Haider og kolleger ⁴ fandt, at inhibering matchede excitation i amplitude under anæstesi henviser under vågenhed, inhibering var stærkere end excitation. Disse resultater bede udvikling af eksperimentelle procedurer for at undersøge virkningen af ​​specifikke synaptiske input på sensorisk forarbejdning i vågne dyr.

<p class = "jove_content"> Den kontrollerede udslyngning af ladede neuroaktive stoffer ved at anvende små nuværende injektioner (på rækkefølgen af NA) er blevet flittigt brugt til at studere bidrag synaptiske input og den rolle af formodede celle receptorer i sensorisk forarbejdning ^8-13 . Denne teknik, der er kendt som microiontophoresis, tillader anvendelsen af ​​lægemidler i nærheden af ​​den indspillede neuron, hvilket bidrager til en hurtig og begrænset virkning. Denne procedure er mere egnet til at studere lokale virkninger af neuroaktive stoffer, sammenlignet med den udbredte virkning fremkaldt af andre eksperimentelle manipulationer såsom systemiske injektioner, mikrodialyse eller anvendelse af optogenetic teknikker. Normalt er en piggy-back elektrode konfiguration ^14,15 bruges til samtidigt at registrere målet neuron og levere de neuroaktive stoffer af interesse. Den består af en optagelse elektrode fastgjort til en multibarrel pipette, der bærer de neuroaktive stoffer. Ændringer af den original procedure beskrevet af Havey og Caspary ¹⁴ er blevet implementeret. For eksempel kan en wolfram elektrode, i stedet for et glas én, bruges til at registrere den neurale aktivitet ^16. Tidligere publicerede metoder til fremstilling af wolframelektroder ^17,18 involverer tre generelle trin: elektrolytisk ætsning af wolfram tråd tips, glas isolering, samt regulering af spidsen eksponering til at opfylde kravene for optagelse.

En interessant og emergent felt i auditive neurovidenskab er studiet af stimulus-specifik tilpasning (SSA ^19). SSA er en specifik reduktion i den neurale respons på gentagne lydsignaler, som ikke generaliserer til andre, sjældent fremlagt lyde. Betydningen af SSA ligger i dets potentielle rolle som en neural mekanisme underliggende afvigelse påvisning i den auditive hjerne, samt en mulig neuronkorrelat for den sene mismatch negativitet komponent af auditive evoked potentiale ^20,21. SSA occurs fra IC op til den auditive cortex ^19,22-24. _{GABAA-medieret} inhibering er blevet påvist at fungere som en gevinst kontrolmekanisme på SSA ^7,16,25, som også er blevet vist at være påvirket af anæstesien ^26. Her præsenterer vi en protokol, der kombinerer tidligere beskrevne fremgangsmåder til registrering af enkelt-enhed aktivitet af IC neuroner før og under påføringen af en selektiv antagonist af _{GABAA-receptorer} i vågen mus. Først beskriver vi fremstilling af piggy-back elektroder og næste, de kirurgiske og indspilningsmetoder. For at teste for effektiviteten af ​​lægemiddelfrigivelse, sammenlignede vi det receptive område såvel som niveauet af SSA IC neuroner før og under microiontophoretic udstødning af gabazine.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev udført på universitetet i Salamanca med godkendelse af, og ved anvendelse af metoder, der opfylder de standarder for, University of Salamanca Animal Care udvalg samt standarderne for Den Europæiske Union (direktiv 2010/63 / EU) for brugen af ​​dyr i neurovidenskab forskning. 1. Wolfram elektroder Bemærk: Fremstillingen af wolframelektroder er baseret på den originale teknikken beskrevet i Merrill og Ainsworth 27 og Ainsworth et al 28</s…

Representative Results

Vi indspillede enkelt enhed aktivitet af 4 velisolerede neuroner i IC. Typiske signal-til-støj-forhold opnået under ekstracellulære optagelser i vågen mus er vist i figur 3B. Figur 4A viser frekvensgangen område (FRA) af hver neuron før og under blokaden af GABAA-receptorer med gabazine. En forøgelse i svaret styrke (pigge / stimulus) samt en udvidelse af den spektrale tuning blev observeret. Forøgelsen i fremkaldt reaktion var også t…

Discussion

Den microiontophoresis af neuroaktive stoffer i vågne dyr er en kraftfuld teknik til at undersøge og dissekere rolle specifikke synaptiske input på aktiviteten af enkelte neuroner ^40,41. Endnu vigtigere, denne procedure muliggør bestemmelse af virkningen af ​​de neurotransmittere og neuromodulatorer på neurale kredsløb uden potentielle forstyrrelser af bedøvelsesmidler. Her viser vi, at anvendelsen af gabazine i IC af vågen mus håndfast ændrede frekvens tuning (figur 4A), de tid…

Materials

Tungsten wire	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 inches x 3 inches
Borosilicate glass capillary	Harvard Apparatus LTD	30-0053	Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long
Multibarrel glass capillaries	World Precision Instruments	5B120F-4	5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament
Diaplus	DiaDent	2001-2101	Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette
G-Bond	GC Corporation	2277	Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull
Araldit Cristal	Ceys		2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette
Heating blanket	Cibertec	RTC1
Stereotactic frame	Narishige	SR-6N	Modified for mice
Microiontophoretic device	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module
Multibarrel glass pipette puller	Narishige	Model PE-21
LED lamp	Technoflux	CV-215	5 W, 430-485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	Flexible plastic needle, 34 AWG
Imalgene	Merial		Ketamine, 100 mg/mL
Rompun	Bayer		Xylazine, 20 mg/mL
Gabazine / SR-95531	Sigma	S106	Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4